Anticuerpos humanizados que reconocen péptido beta-amiloide.

Una inmunoglobulina o un fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a péptidobeta-amiloide (Aß) que comprende (i) una secuencia de la cadena ligera variable madura que comprende losaminoácidos 20-131 de SEC ID Nº:

2 y una secuencia de la cadena pesada variable madura que comprende losaminoácidos 20-142 de SEC ID Nº: 4, o (ii) una cadena ligera variable humanizada que comprende tres CDR deSEC ID Nº: 2 asignadas según Kabat y una cadena pesada variable humanizada que comprende tres CDR de SECID Nº: 4 asignadas según Kabat, en la que la inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de la misma seune a un epítope dentro de los residuos 3-7 de péptido beta-amiloide (Aß) y se une a péptido beta-amiloide (Aß)soluble y agregado.

Anticuerpos humanizados que reconocen péptido beta-amiloide

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva que produce demencia senil. Véase generalmente Selkoe, TINS 16:403 (1993) ; Hardy y col., documento WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994) ; Duff y col., Nature 373:476 (1995) ; Games y col., Nature 373:523 (1995) . En líneas generales, la enfermedad se clasifica en dos categorías: aparición tardía, que se produce en la tercera edad (+ 65 años) y aparición temprana, que se desarrolla mucho antes del periodo senil, es decir, entre 35 y 60 años. En ambos tipos de enfermedad, la patología es la misma, pero las anomalías tienden a ser más graves y generalizadas en casos que empiezan en una edad más temprana. La enfermedad se caracteriza por al menos dos tipos de lesiones en el cerebro, ovillos neurofibrilares y placas seniles. Los ovillos neurofibrilares son depósitos intracelulares de microtúbulos asociados a la proteína tau que consisten en dos filamentos retorcidos el uno alrededor del otro en pares. Las placas seniles (es decir, placas amiloides) son áreas de neuropilo desorganizado de hasta 150 µm a través de depósitos de amiloide extracelulares en el centro que son visibles por análisis microscópico de secciones de tejido de cerebro. La acumulación de placas amiloides dentro del cerebro también está asociada a síndrome de Down y otros trastornos cognitivos.

El principal constituyente de las placas es un péptido llamado péptido Aº o º-amiloide. El péptido Aº es un fragmento interno de 4 kDa de 39-43 aminoácidos de una proteína llamada glucoproteína transmembrana mayor denominada proteína precursora del amiloide (APP) . Como resultado del procesamiento proteolítico de la APP por diferentes enzimas secretasas, el Aº se encuentra principalmente en tanto una forma corta, 40 aminoácidos de longitud, como en una forma larga, que oscila de 42-43 aminoácidos de longitud. Parte del dominio transmembrana hidrófobo de la APP se encuentra en el extremo carboxi de Aº, y puede explicar la capacidad de Aº para agregarse en placas, particularmente en el caso de la forma larga. La acumulación de placas amiloides en el cerebro conduce eventualmente a muerte celular neuronal. Los síntomas físicos asociados a este tipo de deterioro neural caracterizan la enfermedad de Alzheimer.

Varias mutaciones dentro de la proteína APP guardan relación con la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Véanse, por ejemplo, Goate y col., Nature 349:704) (1991) (valina717 a isoleucina) ; Chartier Harlan y col. Nature

353:844 (1991) ) (valina717 a glicina) ; Murrell y col., Science 254:97 (1991) (valina717 a fenilalanina) ; Mullan y col., Nature Genet. 1:345 (1992) (una mutación doble que cambia lisinas595-metioninas596 a asparagina595-leucina596) . Se cree que tales mutaciones producen enfermedad de Alzheimer por procesamiento elevado o alterado de APP a Aº, particularmente procesamiento de APP a cantidades elevadas de la forma larga de Aº (es decir, Aº1-42 y Aº1-43) . Se cree que las mutaciones en otros genes, tales como los genes presenilina, PS1 y PS2, afectan indirectamente el procesamiento de APP para generar cantidades elevadas de la forma larga de Aº (véase Hardy, TINS 20: 154 (1997) ) .

Se han usado satisfactoriamente modelos de ratón para determinar la significancia de placas amiloides en Alzheimer (Games y col., anteriormente, Johnson-Wood y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1550 (1997) ) . En particular, cuando a ratones transgénicos PDAPP (que expresan una forma mutante de APP humana y desarrollan enfermedad de Alzheimer a una edad joven) se les inyecta la forma larga de Aº, muestran tanto una disminución en la progresión de Alzheimer como un aumento en los títulos de anticuerpos para el péptido Aº (Schenk y col., Nature 400, 173 (1999) ) . Las observaciones tratadas anteriormente indican que Aº, particularmente en su forma larga, es un elemento causante en enfermedad de Alzheimer.

El documento WO 01/62801 describe un procedimiento para tratar afecciones caracterizadas por la formación de placas amiloides tanto profilácticamente como terapéuticamente. El procedimiento emplea anticuerpos humanizados que secuestran péptido Aº soluble de líquidos biológicos humanos o que preferentemente se unen específicamente a un epítope contenido dentro de la posición 13-28 del péptido Aº.

El documento EP 0921189 describe animales transgénicos, especialmente ratones, que expresan constitutivamente una molécula de tipo anticuerpo codificada por el transgén y que tienen una región constante de la cadena pesada de IgE y es específica para un antígeno pre-definido. Los animales transgénicos proporcionan una reacción alérgica para ese antígeno sin sensibilización previa y son útiles en modelos de alergia.

El documento WO 02/46237 describe agentes y procedimientos para el tratamiento de enfermedades asociadas a depósitos de amiloide de Aº en el cerebro de un paciente. Agentes preferidos incluyen anticuerpos humanizados.

El documento WO 02/21141 describe la detección, el tratamiento o la prevención de amiloidosis o enfermedades asociadas a amiloide que incluyen procedimientos y composiciones que comprenden vacunas terapéuticas, antisueros y construcciones moleculares que comprenden vectores de expresión y proteínas de fusión codificadas en su interior.

El documento WO 02/088307 describe formas humanizadas del anticuerpo de ratón 10D5 que retienen las propiedades de unión de 10D5 de ratón. También se desvelan procedimientos para preparar el anticuerpo

humanizado y productos intermedios para preparar el anticuerpo humanizado, junto con procedimientos de uso del anticuerpo humanizado para tratar o prevenir síntomas o patología, o ambos, que están asociados a síndrome de Down o enfermedad pre-clínica o clínica de Alzheimer o angiopatía amiloide cerebral.

El documento WO 00/72880 describe agentes y procedimientos para el tratamiento de enfermedades asociadas a depósitos de amiloide de A en el cerebro de un paciente. Tales procedimientos implican administrar agentes que inducen una respuesta inmunogénica beneficiosa contra el depósito de amiloide. Los procedimientos son útiles para el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedad de Alzheimer. Agentes preferidos incluyen fragmentos del extremo N de A y anticuerpos que se unen al mismo.

Por consiguiente, existe la necesidad de nuevas terapias y reactivos para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, en particular terapias y reactivos que puedan efectuar un beneficio terapéutico a dosis fisiológica (por ejemplo, no tóxica) .

Resumen de la invención

La presente invención muestra nuevos reactivos inmunológicos, en particular reactivos de anticuerpos terapéuticos para la prevención y el tratamiento de enfermedad amiloidogénica (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) . La invención se basa, al menos en parte, en la identificación y caracterización de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al péptido A y es eficaz en la reducción de la carga de placas y/o en la reducción de la distrofia neurítica asociada a trastornos amiloidogénicos. El análisis estructural y funcional de este anticuerpo conduce al diseño de diversos anticuerpos humanizados para uso profiláctico y/o terapéutico. En particular, la invención muestra humanización de las regiones variables de este anticuerpo y, por consiguiente, proporciona inmunoglobulina o cadenas de anticuerpos humanizados, inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados intactos e inmunoglobulina funcional o fragmentos de anticuerpos, en particular fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo mostrado.

También se desvelan polipéptidos que comprenden las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo monoclonal mostrado, ya que son reactivos de polinucleótido, vectores y células huésped adecuadas para codificar dichos polipéptidos.

Se desvelan procedimientos de tratamiento de enfermedades o trastornos amiloidogénicos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) , ya que son composiciones farmacéuticas y kits para su uso en tales aplicaciones.

También se muestran procedimientos de identificación de residuos dentro de los anticuerpos monoclonales mostrados que son importantes para la apropiada función inmunológica y para identificar residuos que son aceptados para sustitución en el diseño de anticuerpos humanizados que tienen... [Seguir leyendo]

1. Una inmunoglobulina o un fragmento de unión a antígeno de la misma que se une específicamente a péptido beta-amiloide (A ) que comprende (i) una secuencia de la cadena ligera variable madura que comprende los aminoácido.

2. 131 de SEC ID Nº: 2 y una secuencia de la cadena pesada variable madura que comprende los

aminoácido.

2. 142 de SEC ID Nº: 4, o (ii) una cadena ligera variable humanizada que comprende tres CDR de SEC ID Nº: 2 asignadas según Kabat y una cadena pesada variable humanizada que comprende tres CDR de SEC ID Nº: 4 asignadas según Kabat, en la que la inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de la misma se une a un epítope dentro de los residuos 3-7 de péptido beta-amiloide (A ) y se une a péptido beta-amiloide (A ) soluble y agregado.

2. Una inmunoglobulina quimérica o un fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 que comprende la secuencia de la región variable de la cadena ligera expuesta en SEC ID Nº: 2 y la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEC ID Nº: 4, y secuencias de la región constante de una inmunoglobulina humana.

3. Una inmunoglobulina humanizada de la reivindicación 1, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, comprendiendo la inmunoglobulina humanizada:

(i) una cadena ligera humanizada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la región variable asignadas según Kabat de la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina expuesta como SEC ID Nº: 2 y una región estructural variable de una secuencia de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina aceptora humana; y

(ii) una cadena pesada humanizada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la región variable asignadas según Kabat de la secuencia de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina expuesta como SEC ID Nº: 4 y una región estructural variable de una secuencia de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina aceptora humana.

4. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 3, en la que las CDR de 25 la cadena ligera tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDR1 de la cadena ligera:

Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu (residuo.

4. 58 de SEC ID Nº: 2) ,

CDR2 de la cadena ligera:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (residuo.

7. 80 de SEC ID Nº: 2) ,

CDR3 de la cadena ligera:

Phe GIn Gly Ser His Val Pro Leu Thr (residuo.

11. 121 de SEC ID Nº: 2) ; y

en la que las CDR de la cadena pesada tienen las siguiente secuencias de aminoácidos:

CDR1 de la cadena pesada:

Thr Asn Gly Met Gly Val Ser (residuo.

5. 56 de SEC ID Nº: 4) ,

CDR2 de la cadena pesada:

His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser (residuo.

7. 86 de SEC ID Nº: 4) ,

CDR3 de la cadena pesada:

Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr (residuo.

11. 131 de SEC ID Nº: 4) .

5. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 4, en la que al menos un residuo de la región estructural en al menos una de la cadena ligera o la pesada está sustituido con el residuo de aminoácido correspondiente de la secuencia de la región variable de la cadena ligera de 12B4 de ratón expuesta como SEC ID Nº: 2 o la secuencia de la región variable de la cadena pesada de 12B4 de ratón expuesta como SEC ID Nº: 4, en la que el residuo de la región estructural es:

45 (a) un residuo que se une directamente de manera no covalente a antígeno;

(b) un residuo adyacente a CDR;

(c) un residuo de interacción con CDR; o

(d) un residuo que puede afectar la conformación o la función de la región variable de la cadena ligera como se identifica por análisis de un modelo tridimensional de la región variable.

6. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5, en la que el al menos un residuo de la región estructural es

(a) un residuo que puede interaccionar con antígeno;

(b) un residuo proximal al sitio de unión a antígeno;

(c) un residuo dentro de 6 Å de un residuo de CDR;

(d) un residuo canónico;

(e) un residuo de la zona vernier;

(f) un residuo de acondicionamiento entre cadenas;

(g) un residuo raro;

(h) un residuo de glucosilación sobre la superficie del modelo estructural.

7. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en la que la cadena ligera de la inmunoglobulina aceptora humana comparte al menos el 90 % de identidad de secuencias con la cadena ligera de 12B4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2.

8. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en la que la cadena pesada de la inmunoglobulina aceptora humana comparte al menos el 90 % de identidad de secuencias con la cadena pesada de 12B4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4.

9. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en la que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y el residuo de la región estructural variable L2 según la convención de numeración de Kabat son de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal 12B4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, y en la que el resto de la cadena ligera es de una inmunoglobulina humana.

10. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 38, en la que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y los residuos de la región estructural variable H2, H24, H27, H29, H48, H49, H67, H71 y H78 según la convención de numeración de Kabat son de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 12B4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, y en la que el resto de la cadena pesada es de una inmunoglobulina humana.

11. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 38, en la que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y los residuos de la región estructural variable H24, H27, H29 y H71 según la convención de numeración de Kabat son de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 12B4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, y en la que el resto de la cadena pesada es de una inmunoglobulina humana.

12. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 38, en la que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y los residuos de la región estructural variable H24, H27, H29, H48, H71 y H78 según la convención de numeración de Kabat son de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 12B4 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, y en la que el resto de la cadena pesada es de una inmunoglobulina humana.

13. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 312, en la que la región variable de la cadena ligera es como se expone en los residuos 1-112 de SEC ID Nº: 6.

14. La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 3-13, en la que la región variable de la cadena pesada es como se expone en los residuos 1-123 de SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº: 12.

15. La inmunoglobulina humanizada de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14 que comprende una región Fc que tiene una función efectora alterada.

16. El fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que es un fragmento Fab.

17. La inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que se une específicamente a péptido beta-amiloide (A ) con una afinidad de unión de como máximo 10-7 M, preferentemente como máximo 10-8 M, más preferentemente como máximo 10-9 M.

18. La inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que el isotipo de la cadena pesada es gamma 1.

19. La inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que media en la fagocitosis de péptido beta-amiloide (A ) .

20. La inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que cruza la barrera hematoencefálica en un sujeto.

21. La inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 que reduce la carga de péptido beta-amiloide (A ) de placas en un sujeto.

22. La inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para su uso en terapia.

23. La inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para prevenir o tratar una enfermedad amiloidogénica o para prevenir o tratar enfermedad de Alzheimer o para prevenir o tratar una enfermedad asociada a depósitos de amiloide de A en el cerebro de un paciente, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por deterioro cognitivo, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down o deterioro cognitivo leve en un sujeto que lo necesita.

24. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 y un vehículo farmacéutico.

25. La composición de la reivindicación 24 que está adaptada para proporcionar una dosificación eficaz de dicha inmunoglobulina o fragmento de al menos 1 mg/kg de peso corporal, preferentemente al menos 10 mg/kg de peso corporal.

26. La composición de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, en la que el anticuerpo está adaptado para administrarse por vía intraperitoneal, oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, tópica o intravenosa.

27. Una molécula de ácido nucleico aislada o moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la inmunoglobulina

o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

28. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una secuencia madura y comprende los nucleótido.

5. 393 de SEC ID Nº: 1; los nucleótido.

6. 396 de SEC ID Nº: 5; los nucleótido.

5. 426 de SEC ID Nº: 3; o los nucleótido.

5. 426 de SEC ID Nº: 7.

29. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27 o de la reivindicación 28.

30. Una célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27 o de la reivindicación

28.

31. Un animal transgénico no humano que expresa un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 27 o de la reivindicación 28.

32. El animal transgénico no humano de la reivindicación 31, en el que el polipéptido se expresa en la leche de dicho animal.

33. Un procedimiento de producir una inmunoglobulina, o fragmento de la misma, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 30 en condiciones tales que se produzca la inmunoglobulina o el fragmento y aislar dicha inmunoglobulina de la célula huésped o del cultivo.

34. Una inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-21 para su uso en un procedimiento in vivo de diagnosticar o confirmar el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer o susceptibilidad a la misma por medio de la obtención de imágenes de depósitos de amiloide en el cerebro de un paciente.