Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta.

Método para purificar un anticuerpo anti-Aß que tiene una región Fc desde un líquido de partida que comprende el anticuerpo y una o más impurezas,

que comprende las etapas de:

adsorber el anticuerpo a un agente de unión a Fc que comprende una o más de la Proteína A y la proteína G; lavar el agente de unión a Fc con una solución tampón que contiene CaCl2 a una concentración de 0,5 M a 3 M para eliminar una o más impurezas; y

recuperar el anticuerpo desde el agente de unión a Fc eluyendo el anticuerpo en un tampón de elución con un pH en un intervalo comprendido entre 2 y 4.

Metodos de purificacion de anticuerpos anti A beta. SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica la prioridad sobre la solicitud de patente provisional de Estados Unidos quot;METHODS OF PURIFYING Fc REGION CONTAINING PROTEINSquot;, presentada el 17 de junio de 2005 con numero de serie 60/691821. ANTECEDENTES DE LA INVENCION La enfermedad de Alzheimer (quot;EAquot;) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la aparicion de placas de amiloide, ovillos neurofibrilares y perdida neuronal significativa. La proteina º-amiloide (tambien conocida como peptido Ar) , el principal componente de las placas seniles, ha sido implicada en la patogenesis de la enfermedad de Alzheimer (Selkoe (1989) Cell 58:611-612; Hardy (1997) Trends Neurosci. 20:154-159) . Se ha demostrado que la º-amiloide es directamente toxica para las neuronas cultivadas (Lorenzo y Yankner (1996) Ann. NYAcad. Sci. 777:89-95) e indirectamente toxica a traves de diversos mediadores (Koh et al., (1990) Brain Research 533:315-320; Mattson et al., (1992) J. Neurosciences 12:376-389) . Ademas, los modelos in vivo, incluyendo un modelo en ratas y el de raton PDAPP, han vinculado la º-amiloide a deficits de aprendizaje, modificacion de la funcion cognitiva, e inhibicion de la potenciacion del hipocampo a largo plazo (Chen et al., (2000) Nature 408:975-985; Walsh et al., (2002) Nature 416:535-539) . Por lo tanto, gran parte del interes se ha centrado en las terapias que modifican los niveles de º-amiloide para reducir potencialmente la gravedad o incluso eliminar la propia enfermedad. Una estrategia de tratamiento de la EA que ha surgido recientemente en respuesta a estudios exitosos en modelos experimentales en ratas y en raton PDAPP, es la de la inmunizacion pasiva de individuos para proporcionar inmunoglobulinas tales como anticuerpos especificos para la º-amiloide. (Vease, por ejemplo, Bard et al., (2000) Nat. Med. 6:916-919 y Bard et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 100:2023-2028) . Recientemente, se ha demostrado tambien que la reduccion de Abeta mediante inmunizacion pasiva protege contra la perdida progresiva de la degeneracion sinaptica en un modelo de raton transgenico de la enfermedad de Alzheimer. (Buttini et al., (2005) J. Neurosci. 25:9096-101) . Los recientes avances en la tecnologia recombinante han permitido la produccion de anticuerpos contra virtualmente cualquier diana, por ejemplo, celulas cancerosas, bacterias, y virus. Por lo general, un anticuerpo se produce mediante una linea celular que ha sido modificada por ingenieria genetica para expresar el anticuerpo a niveles altos. La linea celular modificado por ingenieria genetica se desarrolla posteriormente en un cultivo que comprende una mezcla compleja de azucares, aminoacidos y factores de crecimiento, asi como diversas proteinas, incluyendo por ejemplo, proteinas de suero. Sin embargo, separar los anticuerpos completos a partir de subproductos celulares y componentes del cultivo con una pureza suficiente para su uso en investigacion o como productos terapeuticos plantea un tremendo desafio. La purificacion de las moleculas de anticuerpos es especialmente critico si los anticuerpos van a ser utilizados como un farmaco para la administracion a seres humanos. Los esquemas (o trenes) de purificacion tradicionales de anticuerpos comprenden con frecuencia una etapa de cromatografia, que aprovecha la capacidad de la molecula de anticuerpo para ser retenida por o unirse preferentemente a la fase solida (o fase solida funcionalizada) de una columna de cromatografia en comparacion con la union o la retencion de diversas impurezas. Se han propuesto o llevado a cabo esquemas para purificar anticuerpos que primero se unen a proteinas que contienen una region CH2/CH3 a Proteina A inmovilizada sobre una fase solida, seguido de la eliminacion de las impurezas unidas a la fase solida mediante el lavado de la fase solida con un disolvente electrolito hidrofobo y la posterior recuperacion de las proteinas que contienen una region CH2/CH3 desde la fase solida. Sin embargo, estos sistemas estan limitados en lo referente a que las condiciones utilizadas para unirse preferentemente a las proteinas que contienen una region CH2/CH3 tambien soportan la union de las impurezas (por ejemplo, anticuerpos con regiones CH2/CH3 incompletas) . En el desarrollo de la terapeutica humana, tales impurezas resultan muy poco deseables. Por consiguiente, existe la necesidad de mejorar la purificacion de proteinas o polipeptidos que tengan regiones constantes, en concreto, proteinas que tengan regiones Fc (por ejemplo, anticuerpos) , producidas en cultivo celular. El documento EE.UU. 2004/229330 describe un metodo para la purificacion y captura de alta eficiencia de una proteina marcada a partir de una preparacion de proteinas, especialmente una proteina marcada en baja cantidad.

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion presenta metodos de purificacion de anticuerpos que se unen a Ar. Los metodos de la invencion resultan especialmente adecuados para la purificacion de anticuerpos desarrollados para su administracion a seres humanos. En concreto, la invencion presenta la purificacion de anticuerpos anti-Ar producidos en cultivo celular.

En diversos aspectos, la presente invencion presenta metodos para separar un anticuerpo anti-Ar, de un liquido de partida que comprende el anticuerpo y una o mas impurezas. En los metodos de la invencion, el anticuerpo que se une a Ar se adsorbe a un agente de union a Fc que comprende una o mas de la Proteina A y la proteina G y a continuacion el agente de union a Fc se lava con una solucion tampon que contiene CaCl2 0, 5 M a 3, 4 M para eliminar una o mas impurezas. A continuacion se recupera la proteina desde el agente de union a Fc en una solucion de elucion de pH 2 a 4. Los metodos de la invencion resultan especialmente utiles para eliminar impurezas tales como las especies de variantes de ultralectura de intrones (IRT) , las especies con menos enlaces disulfuro (UDB) y/o las especies de variantes de bajo peso molecular (LMW) . Los metodos de la invencion tambien resultan eficaces para eliminar impurezas tales como ADN y proteinas de la celula hospedadora (HCP) .

Los metodos de la presente invencion comprenden una o mas etapas de separacion cromatografica y ademas pueden comprender una o mas etapas de filtracion. Los etapas de separacion cromatografica pueden ser continuas o discontinuas (por ejemplo, un procedimiento por lotes) , o una combinacion de ambas. En diversas formas de realizacion, los metodos comprenden una o mas etapas de filtracion, por ejemplo, para eliminar los virus, concentrar y tamponar la solucion que contiene la proteina diana, y para eliminar contaminantes microbianos.

En diversas formas de realizacion, el anticuerpo anti-Ar es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. En algunas formas de realizacion, el anticuerpo anti-Ar es un anticuerpo que se une especificamente al epitopo dentro de los restos 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 15-24, 16-24, 16-21, 19-22, 33-40, 33-42 de Ar. Unos anticuerpos anti-Ar ejemplares se unen especificamente a un epitopo dentro de los restos 1-10 de Ar, tal como, por ejemplo, dentro de los restos 1-7, 1-5, 3-7 o 3-6 de Ar. Otros anticuerpos anti-Ar ejemplares se unen especificamente a un epitopo dentro de los restos 13-28 de Ar, tal como, por ejemplo, dentro de los restos 16-21 o 19-22 de Ar. Otros anticuerpos anti-Ar ejemplares mas se unen especificamente a un epitopo del extremo C-terminal de Ar tal como, por ejemplo, 33-40 o 33-42 de Ar. En algunas formas de realizacion, el anticuerpo anti-Ar se une a un epitopo discontinuo que incluye los restos dentro de 1-7 y dentro de 13-28 de Ar. Otras formas de realizacion presentan fragmentos Fab, Fab' (2) o Fv de anticuerpos anti-Ar. En algunas de tales formas de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico o un anticuerpo creado mediante el proceso descrito en la publicacion de patente internacional N° WO03/070760.

En una forma de realizacion preferente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-Ar humanizado, y en determinadas formas de realizacion, es un anticuerpo anti-Ar seleccionado del grupo que consiste en 3D6, 10D5, 12B4, 12A11, 15C11 y 266. El isotipo del anticuerpo puede ser IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o cualquier otro isotipo farmaceuticamente aceptable. En las formas de realizacion preferentes, el isotipo es IgG1 humana o IgG4 humana.

En diversas formas de realizacion, el anticuerpo que se une a Ar se produce por recombinacion. En diversas formas de realizacion, el anticuerpo que se une a Ar se produce por recombinacion en una celula de ovario de hamster chino (CHO) .

En diversas formas de realizacion, la una o mas impurezas comprenden una o mas de una proteina de la celula hospedadora, ADN de la celula hospedadora, una proteina... [Seguir leyendo]

1. Metodo para purificar un anticuerpo anti-Ar que tiene una region Fc desde un liquido de partida que comprende el anticuerpo y una o mas impurezas, que comprende las etapas de:

adsorber el anticuerpo a un agente de union a Fc que comprende una o mas de la Proteina A y la proteina G; lavar el agente de union a Fc con una solucion tampon que contiene CaCl2 a una concentracion de 0, 5 M a 3 M para eliminar una o mas impurezas; y recuperar el anticuerpo desde el agente de union a Fc eluyendo el anticuerpo en un tampon de elucion con un pH en un intervalo comprendido entre 2 y 4.

2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha una o mas impurezas estan seleccionadas del grupo que consiste en: especies de variantes de ultralectura de intrones (IRT) , especies con menos enlaces disulfuro (UDB) y especies de bajo peso molecular (LMW) .

3. Metodo segun la reivindicacion 2, en el que dicha una o mas impurezas es una IRT.

4. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo esta seleccionado del grupo que consiste en: una fusion de anticuerpos, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

5. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-Ar humanizado.

, . Metodo segun la reivindicacion 5, en el que el anticuerpo anti-Ar humanizado esta seleccionado del grupo que consiste en:

una version humanizada del anticuerpo 3D6 producido por la linea celular PTA-5130 depositada en la ATCC; una version humanizada del anticuerpo 10D5 producido por la linea celular PTA-5129 depositada en la ATCC; una version humanizada del anticuerpo 12A11 producido por la linea celular PTA-7271 depositada en la ATCC; una version humanizada del anticuerpo 266 producido por la linea celular PTA-6123 depositada en la ATCC; y una version humanizada del anticuerpo 15C11 producido por la linea celular PTA-7270 depositada en la ATCC.

:. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo que tiene una region Fc se produce por recombinacion.

º. Metodo segun la reivindicacion 7, en el que el anticuerpo que tiene una region Fc se produce por recombinacion en una celula de ovario de hamster chino (CHO) .

º. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el agente de union a Fc esta inmovilizado sobre una fase solida.

1º. Metodo segun la reivindicacion 9, en el que la fase solida comprende una o mas de una perla, un gel, una resina, y una particula.

11. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la solucion tampon que contiene el CaCl2 tiene un valor de pH en un intervalo comprendido entre 4 y 8.

12. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la solucion tampon que contiene el CaCl2 tiene un valor de pH en un intervalo comprendido entre 7, 3 y 7, 7.

13. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la solucion tampon tiene una concentracion de CaCl2 en un intervalo comprendido entre 1, 5 M y 2, 0 M.

14. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la solucion tampon comprende CaCl2 2 M.

15. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que las etapas de adsorcion del anticuerpo a un agente de union a Fc y lavado del agente de union a Fc se realizan a una temperatura en el intervalo comprendido entre 2°C y 24°C.

1, . Metodo segun la reivindicacion 2, en el que la una o mas impurezas comprenden adicionalmente uno o mas de una proteina de la celula hospedadora, un ADN de la celula hospedadora, una proteina de cultivo celular, y mezclas de las mismas.

1:. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de recuperacion del anticuerpo desde el agente de union a Fc comprende eluir la proteina utilizando un tampon de elucion con un pH en un intervalo comprendido entre 2, 5 y 3, 5.

1º. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el metodo comprende adicionalmente una etapa de cromatografia seleccionada del grupo que consiste en: cromatografia de intercambio anionico, cromatografia de intercambio cationico, cromatografia de afinidad por iones metalicos inmovilizados y cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC) .

1º. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el metodo comprende adicionalmente una etapa de purificacion adicional seleccionada del grupo que consiste en: cromatografia con hidroxiapatita, dialisis, cromatografia de afinidad, precipitacion con sulfato de amonio, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) , y cromatofocalizacion.

2º. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la una o mas impurezas comprenden una o mas variantes de ultralectura de intrones del anticuerpo y la solucion de elucion que contiene el anticuerpo tiene un nivel de variantes de ultralectura de intrones que es al menos 5 veces inferior al nivel de variantes de ultralectura de intrones en el liquido de partida.

21. Metodo segun la reivindicacion 20, en el que una solucion que contiene el anticuerpo recuperado en la solucion de elucion tiene un nivel de variantes de ultralectura de intrones que es al menos 10 veces inferior al nivel de variantes de ultralectura de intrones en el liquido de partida.

22. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la una o mas impurezas comprenden una o mas variantes de ultralectura de intrones del anticuerpo y las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de un 1% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

23. Metodo segun la reivindicacion 22, en el que las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de un 0, 8% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

24. Metodo segun la reivindicacion 23, en el que las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de un 0, 5% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

25. Metodo segun la reivindicacion 24, en el que las variantes de ultralectura de intrones comprenden menos de un 0, 2% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

2, . Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la una o mas impurezas comprenden una o mas especies de bajo peso molecular del anticuerpo y las especies de bajo peso molecular comprenden menos de un 1% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

2:. Metodo segun la reivindicacion 26, en el que las especies de bajo peso molecular comprenden menos de un 0, 8% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

2º. Metodo segun la reivindicacion 27, en el que las especies de bajo peso molecular comprenden menos de un 0, 5% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

2º. Metodo segun la reivindicacion 28, en el que las especies de bajo peso molecular comprenden menos de un 0, 2% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

3º. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la una o mas impurezas comprenden uno o mas variantes con menos enlaces disulfuro del anticuerpo y las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de un 15% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

31. Metodo segun la reivindicacion 30, en el que las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de un 10% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

32. Metodo segun la reivindicacion 31, en el que las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de un 5% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

33. Metodo segun la reivindicacion 32, en el que las variantes con menos enlaces disulfuro comprenden menos de un 2% de una especie de dicho anticuerpo en la solucion de elucion.

34. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteina de union a Ar es un anticuerpo 3D6 humanizado que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:1 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de los restos 1-448 de la SEQ ID NO:2.

35. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo es del isotipo IgM, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

3, . Metodo segun la reivindicacion 35, en el que el anticuerpo es del isotipo IgG1 humano.