Conjugados de portador peptídico inmunogénico beta y métodos de producir los mismos.

Un conjugado inmunógeno peptídico/transportador de proteína/polipéptido que tiene la fórmula:

**Fórmula**

donde

C es un transportador de proteína CRM197/polipétpido,

Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de aminoácido del transportador de proteína/polipéptido, P es una molécula de inmunógeno peptídico de un fragmento de Aß covalentemente unida al grupo funcional derivatizado del residuo de aminoácido del transportador de proteína/polipéptido, donde el fragmento de Aß se selecciona del grupo consistente en residuos: 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 13- 28, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28, 25-35, 33-42, 35-40 y 35-42 de Aß (SEQ ID NO: 21), R es una molécula de restricción covalentemente unida a su grupo funcional derivatizado de un residuo de aminoácido del transportador de proteína/polipéptido, conservando así la funcionalidad del transportador de tal manera que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmunógeno peptídico que de otra manera se darían sin un transportador,

n es un número entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y

p es un número entero superior a 0, pero inferior a 85.

Antecedentes de la invenciïn La esencia de la inmunidad adaptable es la habilidad de un organismo para reaccionar ante la presencia de sustancias extraïas y producir componentes (anticuerpos o cïlulas) capaces de interactuar especïficamente y proteger al huïsped de su invasiïn. Un “antïgeno” o “inmunïgeno” es una sustancia que es capaz de obtener este tipo de respuesta inmune y tambiïn capaz de interactuar con las cïlulas y anticuerpos sensibilizados que se fabrican contra ïl.

Los antïgenos o inmunïgenos son normalmente macromolïculas que contienen distintos sitios antigïnicos o “epïtopes” que se reconocen e interactïan con los varios componentes del sistema inmune. Pueden existir como molïculas individuales compuestas por sustancias quïmicas orgïnicas sintïticas, proteïnas, lipoproteïnas, glicoproteïnas, ARN, ADN o polisacïridos, o pueden ser parte de estructuras celulares (bacterias u hongos) o virus (Harlow y Lane 1988a, b y c; Male et al., 1987) .

Molïculas pequeïas como pïptidos cortos, aunque normalmente son capaces de interactuar con los productos de una respuesta inmune, a menudo no pueden provocar una respuesta por sï mismas. Estos inmunïgenos de pïptido o “haptenos” como tambiïn se llaman, son realmente antïgenos incompletos, y, aunque no son capaces por sï mismos de provocar inmunogenicidad o de obtener producciïn de anticuerpos, pueden hacerse inmunogïnicos acoplïndolos a un transportador adecuado. Los transportadores tïpicamente son antïgenos de proteïnas de mayor peso molecular que son capaces de provocar una respuesta inmunogïnica cuando se administran in vivo.

En una respuesta inmune, los anticuerpos se producen y secretan por los linfocitos B en conjunto con cïlulas T ayudantes (TA) . En la mayorïa de los sistemas transportadores de haptenos, las cïlulas B producen anticuerpos que son especïficos para el hapteno y el transportador. En estos casos, los linfocitos T tendrïn dominios especïficos de enlace en el transportador pero no reconocerïn al hapteno solo. En un tipo de sinergismo, las cïlulas B y T cooperan para inducir una respuesta de anticuerpo especïfica de hapteno. Despuïs de que haya tenido lugar tal respuesta inmune, si el huïsped es posteriormente desafiado con el hapteno solamente, normalmente responderï produciendo anticuerpos especïficos de hapteno de cïlulas con memoria formadas despuïs de la inmunizaciïn inicial.

Los haptenos sintïticos que imitan algunas estructuras epitïpicas fundamentales en macromolïculas mïs grandes a menudo se conjugan con transportadores para crear una respuesta inmune para la molïcula “original” mïs grande. Por ejemplo, los segmentos de pïptido corto pueden sintetizarse de la secuencia conocida de una proteïna y acoplarse a un transportador para inducir inmunogenicidad hacia la proteïna nativa. Este tipo de planteamiento sintïtico para la producciïn inmunogïnica se ha convertido en la base de muchas de las investigaciones actuales en la creaciïn de vacunas. Sin embargo, en muchos casos, la mera creaciïn de una respuesta de cïlula B usando conjugados sintïticos de pïptido-transportador, aunque bien diseïados, no siempre garantizarï una inmunidad protectora hacia un antïgeno intacto. La respuesta inmune generada por un epïtope de pïptido corto de una partïcula viral mïs grande o cïlulas bacteriana puede ser solamente suficiente para generar memoria en el nivel de cïlula B. En estos casos, ahora generalmente se acepta que una respuesta citotïxica de cïlula BT sea un indicador mïs importante de inmunidad protectora. El diseïo de inmunïgenos peptïdicos con los sitios apropiados de enlace epitïpico para reconocimiento de cïlula B y cïlula T es hoy una de las ïrea de investigaciïn mïs desafiantes en inmunologïa.

El planteamiento para aumentar la inmunogenicidad de molïculas pequeïas y pobremente inmunogïnicas al conjugar estas molïculas con molïculas “transportadoras” grandes se ha utilizado con ïxito durante dïcadas (vïase, por ejemplo, Goebel et al. (1939) J. exp. Med. 69: 53) . Por ejemplo, se han descrito muchas composiciones inmunogïnicas en las que polïmeros capsulares purificados se han conjugado con proteïnas transportadoras para crear composiciones inmunogïnicas mïs efectivas al explotar este “efecto transportador”. Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591) . La conjugaciïn tambiïn ha demostrado evitar la actividad pobre del anticuerpo normalmente observada en niïos cuando se inmunizan con un polisacïrido libre (Anderson et al. (1985) J. Pediatr.

107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med 158: 294) . WO-A-00/050077 describe inmunïgenos peptïdicos unidos a un transportador derivado de Proteïna D de Haemophilus influenzae.

Los conjugados hapteno-transportador se han generado con ïxito usando varios reactivos de enlace cruzado/acoplamiento tal como enlazadores cruzados homobifuncionales, heterobifuncionales o de longitud cero. Muchos de tales mïtodos estïn actualmente disponibles para acoplar sacïridos, proteïnas y pïptidos a transportadores de pïptido. Un inconveniente de usar reactivos de acoplamiento, que introducen sitios reactivos en las cadenas laterales de molïculas de aminoïcido reactivo en el transportador y/o molïculas de hapteno, es que los sitios reactivos si no se neutralizan son libres de reaccionar con cualquier molïcula no deseada in vitro (afectando asï negativamente a la funcionalidad o estabilidad del conjugado (o conjugados) o in vivo (planteando asï un riesgo potencial de hechos adversos en personas o animales inmunizados con las preparaciones) . Tal exceso de sitios reactivos puede reaccionar o “restringirse”, para inactivar estos sitios, utilizando varias reacciones quïmicas conocidas, pero estas reacciones pueden ser de otra manera perjudiciales para la funcionalidad de los conjugados. Estos puede ser particularmente problemïtico cuando se intenta crear un conjugado introduciendo los sitios reactivos en la molïcula transportadora, ya que su mayor tamaïo y su estructura mïs compleja (en relaciïn con el hapteno) puede hacerla mïs vulnerable a los efectos perjudiciales del tratamiento quïmico. De hecho, no se conocen ejemplos de mïtodos por los cuales se haga un conjugado activando primero el transportador, despuïs haciïndolo reaccionar con el hapteno en una reacciïn de conjugaciïn y finalmente “restringiendo” el resto de sitios reactivos, mientras se conserva la habilidad del conjugado resultante para funcionar como una composiciïn inmunogïnica que tiene las propiedades deseadas del “efectos transportador”.

Breve resumen de la invenciïn La presente invenciïn se dirige a un conjugado de inmunïgeno peptïdico-transportador de proteïna/polipïptido como se define en la reivindicaciïn 1. Este es un conjugado inmunogïnico de un inmunïgeno de pïptido que comprende un fragmento de Aβ con un transportador CRM197 proteïnas/polipïptido, donde el fragmento de Aβ se conjuga con el transportador por medio de grupos funcionales derivatizados de residuos de aminoïcido del transportador tales como residuos de lisina, y donde cualquier grupo funcional derivatizado de los residuos de aminoïcido se inactiva por medio de restricciïn para bloquearlos de la reacciïn con otras molïculas, incluyendo proteïnas/polipïptidos conservando de este modo la funcionalidad del transportador, de tal modo que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmunïgeno peptïdico que de otra manera no se darïan sin un transportador. Ademïs, la invenciïn tambiïn se relaciona con composiciones inmunogïnicas que contienen tales conjugados.

La divulgaciïn describe un primer mïtodo de conjugaciïn de un inmunïgeno peptïdico que comprende pïptido Aβ o fragmentos de Aβ o anïlogos del mismo por medio de un grupo reactivo de un residuo de aminoïcido del inmunïgeno peptïdico con un transportador de proteïna/polipïptido que tiene uno o mïs grupos funcionales, comprendiendo el mïtodo las etapas de: (a) derivatizar uno o mïs de los grupos funcionales del transportador de proteïna/polipïptido para generar una molïcula derivatizadas con sitios reactivos; (b) hacer reaccionar el transportador derivatizado de proteïna/polipïptido del a etapa (a) con un grupo reactivo de un residuo de aminoïcido del inmunïgeno peptïdico bajo condiciones de reacciïn de tal manea que el inmunïgeno peptïdico se conjugue con el transportador derivatizado de la proteïna/polipïptido por medio de los grupos funcionales; y (c) hacer reaccionar ademïs el conjugado con un reactivo de restricciïn para inactivar los grupos funcionales reactivos libres en el transportador activado de... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado inmunïgeno peptïdico/transportador de proteïna/polipïptido que tiene la fïrmula:

donde C es un transportador de proteïna CRM197/polipïtpido, Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de aminoïcido del transportador de proteïna/polipïptido, P es una molïcula de inmunïgeno peptïdico de un fragmento de Aβ covalentemente unida al grupo funcional derivatizado del residuo de aminoïcido del transportador de proteïna/polipïptido, donde el fragmento de Aβ se selecciona del grupo consistente en residuos: 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-9, 1-10, 1-11, 1-12, 1-16, 1-28, 3-6, 3-7, 1328, 15-24, 16-22, 16-23, 17-23, 17-24, 18-24, 18-25, 17-28.

2. 35.

3. 42.

3. 40 .

3. 42 de Aβ (SEQ ID NO: 21) , R es una molïcula de restricciïn covalentemente unida a su grupo funcional derivatizado de un residuo de aminoïcido del transportador de proteïna/polipïptido, conservando asï la funcionalidad del transportador de tal manera que retiene su habilidad para obtener las respuestas inmunes deseadas contra el inmunïgeno peptïdico que de otra manera se darïan sin un transportador, n es un nïmero entero superior a 0, pero inferior o igual a 85, y p es un nïmero entero superior a 0, pero inferior a 85.

2. El conjugado de la reivindicaciïn 1, donde el inmunïgeno peptïdico comprende ademïs un residuo de cisteïna terminal y el inmunïgeno peptïdico estï covalentemente unido al grupo funcional derivatizado del residuo de aminoïcido del transportador de proteïna/polipïptido por medio del residuo de cisteïna terminal.

3. El conjugado de la reivindicaciïn 2, donde el residuo de cisteïna terminal estï situado en la terminal carboxi o la terminal amino del inmunïgeno peptïdico.

4. El conjugado de la reivindicaciïn 3, donde el residuo de cisteïna terminal estï situado en el terminal carboxi del inmunïgeno peptïdico.

5. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el fragmento de Aβ comprende residuos 1-7 de Aβ (SEQ ID NO. 21) .

6. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la molïcula de restricciïn estï formada por la reacciïn del conjugado con un reactivo de restricciïn seleccionado del grupo consistente en cisteamina, Cacetilcisteamina, etanolamina, amoniaco, bicarbonato de amonio, hidrïxido de sodio y carbonato de sodio.

7. El conjugado de la reivindicaciïn 5, donde el fragmento de Aβ es residuos 1-7 de Aβ (SEQ ID NO. 21) .

8. El conjugado de la reivindicaciïn 7, donde el inmunïgeno peptïdico es DAEFRHD-C (SEQ ID NO: 2) .

9. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la molïcula de restricciïn estï formada por la reacciïn del conjugado con N-acetilcisteamina.

10. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde Xd es un grupo funcional derivatizado de un residuo de lisina.

11. El conjugado de la reivindicaciïn 1 que tiene la fïrmula:

12. El conjugado de la reivindicaciïn 11, donde n es 12, 14 ï 15.

13. Una composiciïn inmunogïnica, que comprende un conjugado de un inmunïgeno peptïdico con un transportador de proteïna/polipïptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, junto con uno o mïs excipientes, diluyentes y/o adyuvantes farmacïuticamente aceptables.

14. La composiciïn inmunogïnica de la reivindicaciïn 13, donde uno o mïs adyuvantes se seleccionan del grupo consistente en GM-CSF, 529 SE, IL-12, fosfato de aluminio, hidrïxido de aluminio, Mycobacterium tuberculis, Bordetella pertussi, lipopolisacïridos bacterianos, compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina, MPL™ (3-Olïpido A de monofosforil deacilado) , un polipïptido, Quil A, STIMULON™ QS-21, una toxina de pertussis (TP) , y toxina termolïbil de E. coli (LT) , IL-1 α, IL-1 β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferïn-α, interferïn-β, interferïn-γ, G-CSF, TNF-α y TNF-β.