Anticuerpos alterados.

Un anticuerpo alterado de la clase IgG que comprende al menos una cadena ligera kappa humana,

que comprende dicha alteración, en el que la alteración comprende la sustitución del residuo 171, numerado según el 5 sistema de numeración de Kabat, de la al menos una cadena ligera kappa por un residuo de cisteína.

Anticuerpos alterados La presente invención se refiere a la modificación por ingeniería genética de anticuerpos y más específicamente proporciona anticuerpos alterados de la clase IgG a los que se unen una o más moléculas efectoras. Se proporcionan además métodos para su producción.

Los anticuerpos son generalmente moléculas con forma de Y que comprenden dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Enlaces disulfuro unen entre sí los pares de cadenas pesadas y ligeras, cuya parte Nterminal comprende los sitios de unión a antígeno. Enlaces disulfuro también unen entre sí las dos cadenas pesadas, cuya parte C-terminal (la parte Fc) carece de la capacidad de unirse a antígeno. Esta parte Fc está implicada en la mediación de actividades tales como fijación del complemento, paso transplacentario y unión a diversos tipos de células. Las funciones efectoras asociadas con la unión a Fc incluyen, por ejemplo, fagocitosis, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y endocitosis. Estas funciones pueden ser de importancia en la mediación del efecto terapéutico de un anticuerpo. Conjugados de anticuerpo-fármaco con el potencial para la función efectora son normalmente de la clase IgG1.

La alta especificidad y afinidad de los anticuerpos los hace agentes terapéuticos y de diagnóstico ideales, particularmente para modular las interacciones proteína:proteína. Se demuestra que tanto anticuerpos completos como fragmentos de anticuerpo modificados por ingeniería genética son agentes terapéuticos versátiles, tal como se observa por el reciente éxito de productos tales como ReoPro (fragmento Fab de anticuerpo quimérico) , Rituxan (IgG1 quimérica) , RemicadeTM (IgG1 quimérica) , Herceptin (IgG1 humanizada) y Humira (IgG1 humana) . Específicamente de interés son anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos que tienen como objetivo reducir o eliminar la inmunogenicidad inherente asociada con anticuerpos monoclonales no humanos.

De particular interés terapéutico son conjugados de anticuerpos en los que una molécula efectora tal como un fármaco, una toxina o un marcador se une al anticuerpo. Pueden unirse moléculas efectoras a fragmentos de anticuerpo mediante varios métodos diferentes, incluyendo a través de azúcares de aldehído o más comúnmente a 30 través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal ubicado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. El sitio de unión de moléculas efectoras puede ser o bien aleatorio o bien específico de sitio. La unión aleatoria se logra a menudo a través de aminoácidos tales como lisina y esto da como resultado moléculas efectoras que se unen en varios sitios por todo el fragmento de anticuerpo dependiendo de la posición de las lisinas. Aunque esto ha sido satisfactorio en algunos casos el número y la ubicación exacta de las moléculas efectoras unidas no puede controlarse y esto puede conducir a pérdida de actividad, por ejemplo si se unen demasiado pocas, o puede conducir a pérdida de afinidad, por ejemplo si la unión interfiere con el sitio de unión a antígeno (Chapman 2002 Advanced Drug Deliver y Reviews, 54, 531-545) . Como tal, el acoplamiento es aleatorio dando como resultado un producto de conjugado de anticuerpo definido por la enfermedad, no homogéneo.

En cambio, la unión específica de sitio controlada de moléculas efectoras, tal como la unión mediante residuos de cisteína existentes, ofrece considerables ventajas con respecto a la unión de sitio aleatorio. No obstante, la unión específica de sitio tiene resultados impredecibles porque puede haber pérdida de función efectora de Fc y/o pérdida de la capacidad de unión a antígeno a través de la alteración de la estructura terciaria. Anticuerpos con uno o más 45 residuos de cisteína introducidos por ingeniería genética padecen también estos últimos problemas; por ejemplo, el/los residuo (s) de cisteína introducido (s) por ingeniería genética pueden formar un enlace disulfuro con un tiol libre existente presente dentro del anticuerpo. La presente invención, sin embargo, proporciona anticuerpos con al menos un residuo mutado específico de sitio que permite la producción de un producto bien definido homogéneo que conserva la capacidad de unión a antígeno y, cuando el anticuerpo es un anticuerpo completo, un producto bien 50 definido homogéneo que también conserva la función efectora de la región Fc potencial.

El documento WO 2006034488 da a conocer varios anticuerpos en los que residuos de cadena pesada y ligera específicos se han mutado a un residuo de cisteína. Sin embargo, el documento WO 2006034488 no da a conocer específicamente la mutación de los residuos de la cadena ligera kappa 171, 156, 202 o 203 de una IgG humana a un 55 residuo de cisteína.

Por tanto, la presente invención proporciona la primera descripción de la mutagénesis de uno cualquiera o más de los residuos 171, 156, 202 y 203 (numerados según el sistema de numeración de Kabat expuesto en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, 60 EE.UU.) de la cadena ligera kappa a un residuo de cisteína, que permite la unión específica de sitio de una molécula efectora al residuo mutado. Además, la invención proporciona un anticuerpo alterado en la posición equivalente, numerada según el sistema de numeración de Kabat, en la cadena ligera lambda.

Renard et al (2004, Biochemistr y , vol. 43, páginas 15453-153462) dan a conocer mejoras en la sensibilidad y el 65 intervalo dinámico de inmunosensores fluorescentes sin reactivos mediante diseño basado en el conocimiento.

Shopes et al (1993, Molecular Immunology, páginas 603-609) dan a conocer que una IgG humana modificada por ingeniería genética con flexibilidad limitada inicia la citólisis mediante el complemento.

Butlin et al (2006, Accounts of Chemical Research, vol. 39, páginas 780-787) dan a conocer anticuerpos con afinidad 5 infinita: orígenes y aplicaciones.

Renard et al (2006, Journal of Molecular Biology, páginas 167-175, ISSN: 0022-2836) dan a conocer la derivación de restricciones topológicas a partir de datos funcionales para el diseño de inmunosensores fluorescentes sin reactivos.

Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo alterado de la clase IgG que comprende al menos una cadena ligera kappa humana, que comprende dicha alteración, en el que la alteración comprende sustituir el residuo 171, numerado según el sistema de numeración de Kabat, de la al menos una cadena ligera kappa por un residuo de cisteína.

La clase IgG de un anticuerpo de la invención puede ser la subclase humana IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En particular, pueden usarse los isotipos IgG1 e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a usos terapéuticos y se desean las funciones efectoras del anticuerpo, por ejemplo, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Lo más preferiblemente, cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el anticuerpo pertenece a la subclase IgG1. Alternativamente, pueden usarse los isotipos IgG2 e IgG4 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a fines terapéuticos en los que no se requieren las funciones efectoras del anticuerpo.

Por tanto, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos que tienen función efectora y, por tanto, pueden mediar ADCC y/o CDC. Por consiguiente, en un aspecto, se proporcionan anticuerpos alterados de la invención que efectúan ADCC y/o CDC. En otro aspecto, el anticuerpo tiene un efecto funcional, por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo bloqueante, un anticuerpo neutralizante, un anticuerpo agonista o uno antagonista. Lo más preferiblemente, un anticuerpo que media ADCC o CDC tiene también un efecto funcional adicional, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo bloqueante o neutralizante que impide o interfiere con la unión del antígeno, por ejemplo un ligando. Alternativamente, o adicionalmente, el anticuerpo puede inhibir o activar una ruta de señalización directa o indirectamente. En otro aspecto de la invención, puede usarse un anticuerpo para inhibir la actividad de su antígeno relacionado. En un aspecto adicional, el anticuerpo es proapoptótico.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra un antígeno deseado administrando el antígeno a un sujeto, preferiblemente un animal... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo alterado de la clase IgG que comprende al menos una cadena ligera kappa humana, que comprende dicha alteración, en el que la alteración comprende la sustitución del residuo 171, numerado según el 5 sistema de numeración de Kabat, de la al menos una cadena ligera kappa por un residuo de cisteína.

2. El anticuerpo alterado según la reivindicación 1 ó 2, que es un Fab, un Fab’ o un F (ab’) 2.

3. El anticuerpo alterado según la reivindicación 1 ó 2, que está conjugado con una o más moléculas efectoras. 10

4. El anticuerpo alterado según la reivindicación 3, en el que la molécula efectora comprende uno o más agentes citotóxicos, radionúclidos o restos farmacológicos, o uno o más polímeros.

5. El anticuerpo alterado según la reivindicación 4, en el que el polímero es una molécula de PEG. 15

6. La molécula de anticuerpo según la reivindicación 5, en la que el PEG tiene un peso molecular en el intervalo de desde aproximadamente 20.000 hasta 40.000 Da.

7. La molécula de anticuerpo según la reivindicación 5, en la que el PEG tiene un peso molecular de 20 aproximadamente 20.000 Da.

8. El anticuerpo alterado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano.

9. Un método para la unión específica de sitio de una molécula efectora a un anticuerpo de la clase IgG que comprende al menos una cadena ligera kappa que comprende combinar una muestra que comprende un anticuerpo con un agente reductor de monotiol o un agente reductor de multitiol que no puede formar enlaces disulfuro intramoleculares a una concentración en el intervalo de desde 1 hasta 8 mM, en el que el anticuerpo es un anticuerpo alterado para que contenga la cisteína 171 de la al menos una cadena ligera kappa, numerada según el sistema de numeración de Kabat.

10. El método según la reivindicación 9, en el que el agente reductor es 2-mercaptoetilamina a una concentración en el intervalo de desde 1 mM hasta 3 mM.

11. El método según la reivindicación 9, en el que el agente reductor es 2-mercaptoetilamina a una concentración en el intervalo de desde 1 mM hasta 2 mM.