Compuesto seleccionado del siguiente grupo:

asi como los correspondientes esteres N-hidroxisuccinimidilicos.

o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereoisómeros o enantiómeros.

Agentes citot6xicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapeutico CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapeutico como agentes citot6xicos. El uso terapeutico es el resultado de distribuir los derivados de tomaimicina en una población celular especifica de una manera dirigida por unión mediante enlaces quimicos del derivado de tomaimicina con un agente de unión a la celula. La invención tambien se refiere a moleculas conjugadas que comprenden uno o mas de dichos derivados de tomaimicina unidos mediante enlaces quimicos a un agente de unión a la celula opcionalmente modificado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Se han descrito muchos intentos de dirigir especificamente conjugados anticuerpo monoclonal-farmaco a celulas tumorales (Sela et al., en Immuno-conjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987) ; Ghose et al., en Targeted Drugs 1-22

(E. Goldberg; ed. 1.983) ; Diener et al, en Antibody mediated deliver y systems, 1-23 (J. Rodwell, ed. 1.988) ; Pietersz et al, en Antibody mediated deliver y systems, 25-53 (J. Rodwell, ed. 1.988) ; Bumol et al, en Antibody mediated deliver y systems, 55-79 (J. Rodwell, ed. 1.988) ; G.A. Pietersz & K. Krauer, 2, J. Drug Targeting, 183-215 (1.994) ; R.

V. J. Chari, 31 Adv. Drug Deliver y Revs., 89-104 (1998) ; w.A. Blattler & R.V.J. Chari, en Anticancer Agents, Frontiers in Cancer Chemotherapy, 317-338, ACS Symposium Series 796; Ojima et al eds, American Chemical Society 2.001; J.M.Lambert, 5 Current Opinion in Pharmacology, 543-549 (2.005) ; P.R. Hamann, 15 Expert Opinion on Therapeutics Patents, 1.087-1.103 (2.005) ) . Todas las referencias y patentes citadas en la presente memoria se incorporan como referencia.

Se han conjugado farmacos citot6xicos, tales como: metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C y clorambucilo, con varios anticuerpos monoclonales murinos. En algunos casos, las moleculas del farmaco se unieron a las moleculas de anticuerpo a traves de una molecula portadora intermedia, tal como albumina serica (Garnett et al., 46 el Cancer Res. 2.407-2.412 (1.986) ; Ohkawa et al 23, Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1.986) ; Endo et al, 47 Cancer Res. 1.076-1.080 (1.980) ; dextrano (Hurwitz et al, 2 Appl. Biochem. 25-35 (1.980) ; Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1.985) ; Dillman et al, 46 Cancer Res., 4.886-4.891 (1.986) ; Shoval et al, 85, Proc. Natl. Acad. Sci., 8.276-8.280 (1.988) ) o acido poliglutamico (Tsukada et al, 73, J. Natl. Canc. Inst., 721-729 (1.984) ; Kato et al, 27 J. Med. Chem., 1.602-1.607 (1.984) ; Tsukada et al, 52, Br.

J. Cancer, 111-116 (1.985) ) .

Se ha empleado una amplia serie de tecnologias de ligantes para la preparación de tales inmunoconjugados y se han investigado tanto ligantes escindibles como no escindibles. En la mayoria de los casos, el alto potencial citot6xico de los farmacos sólo podia observarse, sin embargo, si se podian liberar las moleculas de farmaco de los conjugados en forma no modificada en el sitio diana usando un ligante escindible.

Los ensayos in vitro de citotoxicidad han revelado, sin embargo, que los conjugados anticuerpo-farmaco podian destruir no sólo celulas positivas de antigeno sino tambien otras celulas en los alrededores, con independencia de la expresión del antigeno en su superficie. Este fen6meno se denomina el efecto espectador. Este efecto se observ6 en conjugados del anticuerpo anti-CanAg; huC242, con maitansinoides y con un analogo CC1065 (Erickson et al, 66 Cancer Res., 4.426-4.433 (2.006) ; Kovtun et al, 66 Cancer Res., 3.214-3.221 (2.006) ) . Hasta ahora sólo los conjugados unidos mediante un enlace escindible tal como un enlace disulfuro reducible, demostraron citotoxicidad del espectador, mientras los conjugados unidos mediante un enlace tioeter no reducible no presentaban efecto espectador.

Las moleculas efectoras citot6xicas muy potentes unidas a agentes diana tales como anticuerpos podian generar potentes derivados de farmacos despues del proceso intracelular del conjugado. Esto podia ser un problema si los metabolitos celulares generados manifestaran efectos secundarios no deseados o no facilmente manejables. Para controlar la toxicidad de conjugados anticuerpo-farmaco, podia ser muy beneficioso usar ligantes no escindibles.

Otra desventaja principal de la mayoria de los conjugados anticuerpo-farmaco es su incapacidad para suministrar una concentración suficiente de farmaco al sitio diana debido al numero limitado de antigenos diana y la citotoxicidad relativamente moderada de los farmacos canceroestaticos como: metotrexato, daunorubicina y vincristina. Para conseguir una citotoxicidad significativa, se hace necesaria la unión de un gran numero de moleculas de farmaco, bien directamente al anticuerpo o mediante una molecula portadora polimerica. Sin embargo, tales anticuerpos modificados de forma importante presentan a menudo una unión debilitada con el antigeno diana y una eliminación in vivo rapida del torrente circulatorio. Asi, una alternativa es usar moleculas de farmacos mucho mas potentes tales como las descritas a continuación.

Tambien se han usado en conjugación ligantes no escindibles. Tienen interes en aplicaciones radioinmunoterapeuticas en particular. Esto se ha utilizado tambien en la unión de toxinas a anticuerpos monoclonales, en cuanto a Pseudomonas exotoxina con MAb 9.2.27 usando 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1carboxilato de maleimidasuccinimidilo (SMCC, por sus siglas en ingles) heterobifuncional (patente europea EP 306943) . La toxina conjugada MAb resulta tener mayor especificidad in vitro frente a lineas celulares positivas que el

correspondiente conjugado de enlace disulfuro y asi menos t6xica en modelos de ratones. La toxicidad no especifica disminuye significativamente cuando se usa un ligante no escindible. Este ligante no escindible se ha usado en el caso de trastuzumab (Herceptina) cuya diana HER2 (ErbB) HERR2 es una diana clave y se estan investigando metodos para maximizar el efecto de usar MAbs para inhibir a este receptor. Una propuesta se dirige a aumentar la eficacia de trastuzumab (Herceptina) acoplandolo a un agente quimioterapeutico, permitiendo asi la administración de tratamiento citot6xico a un nivel celular (Ranson and Sliwkowski, 63 (Supl. 1) Oncology, 17-24 (2.002) ) .

Existen otras versiones del reactivo SMCC, por ejemplo tambien se ha usado 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) soluble en agua, en reacción de conjugación. Otros ligantes no escindibles incluyen en particular S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA) , SATA-SMCC, 2-iminotiazol (2IT) y 2IT-SMCC (Foulon et al, 10, Bioconjugate Chem., 867-876 (1.999) ) . Tambien se han usado reactivos de acoplamiento que comprenden un resto basado en haloacetilo e incluyen 4- (yodoacetil) -aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB) yodoacetato de N-succinimidilo (SIA) , bromoacetato de N-succinimidilo (SBA) y 3- (bromoacetamido) propionato de N-succinimidilo (SBAP) . Estos reactivos de entrecruzamiento forman ligantes no escindibles procedentes de restos basados en haloacetilo.

A pesar de las dificultades descritas anteriormente debido a las moleculas de farmaco, se han descrito agentes citot6xicos utiles que comprenden restos de unión a la celula y el grupo de farmacos citot6xicos conocidos como maitansinoides (patente de EE.UU. 5.208.020, patente de EE.UU. 5.416.064 y R. V. J. Chari, 31 Advanced Drug Deliver y Reviews 89-104 (1.998) ) . De manera similar, tambien se han descrito agentes citot6xicos utiles que comprenden restos de unión a la celula y analogos y derivados del potente antibi6tico antitumoral CC-1065 (patentes de EE.UU. 5, 475, 092, 5, 585, 499 y 6, 756, 397) .

Los derivados de tomaimicina son pirrolo[1.4]benzodiazepinas (las PBD) , una clase conocida de compuestos que ejercen sus propiedades biológicas por medio de la unión covalente al N2 de guanina en el surco menor del ADN. Las PBD incluyen una serie de aglutinantes de surco menor tales como antramicina, neotramicina y DC-81. Sin embargo, la actividad antitumoral de la tomaimicina esta limitada sin embargo debido a su toxicidad no especifica para las celulas normales. De esta manera, existe la necesidad de aumentar la actividad terapeutica y disminuir los efectos t6xicos no especificos de los compuestos de tomaimicina. Los presentes autores han demostrado que esta necesidad puede satisfacerse por la liberación dirigida de compuestos de tomaimicina por medio de su unión con agentes de unión a la celula. Adicionalmente, existe la necesidad de desarrollar... [Seguir leyendo]

1. Compuesto seleccionado del siguiente grupo:

asi como los correspondientes esteres N-hidroxisuccinimidilicos.

o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polim6rficas de estos compuestos o sus is6meros ópticos, racematos, diastereois6meros o enanti6meros.

2. Un compuesto segun la reivindicación 1 que tiene la siguiente nomenclatura :

acido 4- (3, 5-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi) -butirico ; acido 4- (3, 5-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8

iloximetil]-fenoxi) -acetico;

acido 3- (2-{2-[2- (3, 5-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona8-iloximetil]-fenoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -propiónico; acido 6- (3, 5-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4] benzodiazepin-5-ona-8

iloximetil]-fenil) -hex-5-inoico;

acido 3- (2-{2-[2- (2, 6-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona8-iloximetil]-piridin-4-iloxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -propiónico; acido 4- (2, 6-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8

iloximetil]-piridin-4-iloxi) -butirico;

acido N-[2- (3, 5-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi) -etil]-N-metil-succinamico; acido 4- (3, 5-Bis-[ (S) -2-metiliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8

iloximetil]-fenil) -propanoico;

acido (2-{2-[2- (2-{3-[3, 5-Bis- (7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 5, 11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2a][1.4]diazepin-8-iloximetil) -fenil]-propoxi}-etoxi) etoxi]-etoxi}-etoxi) -acetico; acido (3-{2-[2- (2-{3-[3, 5-Bis- (7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2, 3, 5, 11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2

a][1.4]diazepin-8-iloximetil) -fenil]-propoxi}-etoxi) etoxi]-etoxi}-etoxi) -propanoico; asi como los correspondientes esteres N-hidroxisuccinimidilicos.

o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polim6rficas de estos compuestos o sus is6meros ópticos, racematos, diastere6meros o enanti6meros.

3. Una molecula de conjugado que comprende uno o mas compuesto (s) segun la reivindicación 1 ó 2 unida covalentemente a un agente de unión a la celula mediante el grupo ligante -COOHo de un ligante del (de los) compuesto (s) .

4. Un conjugado segun la reivindicación 3 en donde el agente de unión a la celula esta modificado con un agente de modificación para mejorar la reactividad de dicho agente de unión a la celula hacia el grupo ligante -COOH o del ligante del compuesto.

º. Una molecula de conjugado de acuerdo con la reivindicación 3 6 4, en la que dicho agente de unión a la celula se elige de anticuerpos o un fragmento de un anticuerpo que contenga al menos un sitio de unión, linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, moleculas para transporte de nutrientes o cualquier otra molecula o sustancia de unión a la celula.

6. Una molecula de conjugado de acuerdo con la reivindicación 3 a 5, en la que dicho agente de unión a la celula se elige de anticuerpos monoclonales; anticuerpos quimericos; anticuerpos humanizados; anticuerpos totalmente humanos; anticuerpos monocatenarios; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F (ab') 2 y Fv, interferones; peptidos; linfocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; hormonas tales como insulina, TRH (hormonas liberadoras de tirotropina) , MSH (hormona estimuladora de melanocitos) , hormonas esteroideas, tales como andr6genos y estr6genos; factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGFa, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF y GM-CSF; vitaminas, tales como folato y transferrina.

7. Una molecula de conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que el agente de unión a la celula y dicho (s) compuesto (s) estan unidos por un grupo amido.

8. Proceso de preparación de una molecula de conjugado unida por amida en la que el agente de unión a la celula se hace reaccionar con el compuesto acido de N-hidroxi-succinimida de la reivindicación 1 6 2.

9. Un proceso segun la reivindicación 8 en donde el agente de unión a la celula esta modificado con un agente de modificación para mejorar la reactividad de dicho agente de unión a la celula hacia el grupo ligante -COOH o del ligante del compuesto.

10. Un proceso segun las reivindicaciones 8 6 9 en donde el agente de unión a la celula es una anticuerpo o un anticuerpo monoclonal.

11. Un proceso segun las reivindicaciones 8 a 10 en donde el conjugado se purifica mediante cromatografia de exclusión de tamano, cromatografia de adsorción, cromatografia de intercambio iónico, cromatografia de

interacción hidrófoba, cromatografia de afinidad, HPLC, cromatografia sobre hidroxiapatita, dialisis o diafiltración.

12. Una composición farmaceutica que comprende una molecula de conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o un compuesto como se define en las reivindicaciones 1 o 2 junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

13. Uso de una cantidad efectiva de una molecula de conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o un compuesto como se define en las reivindicaciones 1 o 2, junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable para la preparación de un medicamento para tratar el cancer.

14. Compuesto seleccionado del siguiente grupo:

Fig. 1. Curvas de la determinacion de la potencia in vitro del ester metilico del acido 4- (3, º -Bis-[ (S) -2-et (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro- pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -butirico del ej. 1.

Fig. 2. Curvas de la determinacion de la potencia in vitro del ester metilico del acido 4- (3, º -Bis-[ (S) -2-et (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -acetico del ej. 2.

Fig. 3. Curvas de la determinacion de la potencia in vitro de compuestos 8 (IGP08) Y 9 (IGP08-OMe) del ejemplo 8 mostrando maYor potencia para el ester IGP08-OMe que para el acido IGP08

Fig. 4. Analisis MS (espectro de masas) del conjugado huMY9-6 desglucosilado -4- (3, º -Bis-[ (S) -2-et- (E) iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -butirilo (2, 1 FarmacoºAb por UV) del ej. 11

D0 D1 D2 D3

Fig. º. Analisis MS del conjugado huB4 desglucosilado -4- (3, º -Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -butirilo (4, 48 FºA por UV) del ej. 12

4º1

Fig. 6. Analisis MS del conjugado hu2H11 desglucosilado-4- (3, º -Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -butirilo (3, 74 FºA por UV) del ej. 13

Fig. 7. Analisis MS del conjugado huMY9-6 -3 - (2-{2-[2- (3, º -Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) -propionilo (4, 80 FºA por UV) del ej. 14

Fig. 8. Analisis MS de conjugado hu2H11 desglucosilado-3- (2-{2-[2- (3, º -Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) propionilo (4, 08 FºA por UV) del ej. 1º Fig. 9. Analisis por espectro de masas de huMY9-6 desglucosilado -IGP08; (FarmacosºAnticuerpo = 4, 2) del ejemplo 18

Fig. 13. Citotoxicidad: huB4-IGP08 (3, 1 FºA) frente a celulas BºAB (Agº) , Ramos (Agº) Y MOLT-4 (Ag-)

Fig. 14. Union de anticuerpo hu-B4 Y conjugado huB4-IGP08 del ejemplo 19 Fig. 1º. Analisis MS de hu2H11 desglucosilado - IGP-13 (4, 7 FºA por UV) del ej. 21

Fig.17. Datos de citotoxicidad in vitro para ester metilico del acido 3- (2-{2-[2- (2, 6-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi) -etoxi]-etoxi}etoxi) -propionico del ej.

Fig.18. Datos de citotoxicidad in vitro para el ester metilico del acido 4- (2, 6-Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi) -butirico del ej. 6

Fig. 20. Datos de citotoxicidad in vitro para conjugado huMY9-6 - 4- (3, º -Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -butirilo del ej. 11, en celulas HL60ºATCC (Agº) Y Ramos (Ag-)

Fig. 21: Datos de citotoxicidad in vitro para conjugado huB4 -4- (3, º -Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7-metoxi-1, 2, 3, 11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -butirilo del ej. 12, en celulas Ramos (Agº) Y MOLT-4 (Ag-) Fig. 23 Datos de citotoxicidad in vitro para conjugado huMY9-6 -3 - (2-{2-[2- (3, º -Bis-[ (S) -2-et- (E) -iliden-7metoxi-1, 2, 3, 11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi) -etoxi]-etoxi}-etoxi) propionilo del ej. 14, en celulas HL60ºATCC (Agº) Y Ramos (Ag-)

Fig Fig. 24 Datos de citotoxicidad in vitro para conjugado hu2H11 -3- (2-{2-[2- (3, º -Bis-