Uso de Estefina A como una proteína de armazón, en el que la Estefina A es una Estefina A humana,

y en el que los aminoácidos 71 a 73 de Estefina A están sustituidos por una inserción peptídica heteróloga

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a proteínas de armazón para presentar péptidos tales como aptámeros peptídicos. En particular, la invención se refiere al uso de estefina A como proteína de armazón, y a polipéptidos de estefina A modificados para uso como proteínas de armazón.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El estudio de las interacciones proteicas es importante para una comprensión de los papeles biológicos de productos génicos in vivo. Existen numerosas formas de analizar

o diseccionar interacciones polipeptídicas, y una de las más poderosas es mediante el uso de aptámeros peptídicos y el estudio de su comportamiento. Los péptidos y aptámeros peptídicos se pueden usar libres en disolución. Sin embargo, cuando los péptidos pequeños no están constreñidos tenderán a formar estructuras que presentan una superficie de interacción limitada. Además, a menudo perderán entropía conformacional al asociarse con moléculas diana, reduciendo la energía libre de unión, y en consecuencia los péptidos libres a menudo no formarán complejos no covalentes apretados, lo que es un problema.

En lugar de ser usados en disolución libres, los péptidos de interés se pueden unir a soportes físicos, o se pueden presentar en el contexto de un polipéptido más grande. En la presente invención, es importante la presentación en el contexto de un polipéptido. Tal presentación a menudo es provocada usando proteínas de armazón.

En la técnica anterior se han producido y usado armazones proteicos manipulados mediante ingeniería, para el reconocimiento molecular. Por ejemplo, Skerra (2003 Curr Opin Chem Biol. vol. 7 páginas 683-93) escribe sobre armazones usados para la generación de proteínas receptoras artificiales con especificidades definidas. Según Skerra, los mejores armazones deberían de tener una arquitectura robusta, un tamaño pequeño, ser monoméricos, ser susceptibles a manipulación proteica mediante ingeniería (por ejemplo, proteínas de fusión), y tener un bajo grado de modificación posttraduccional. Además, los armazones más ventajosos deberían de ser fácilmente expresables en células hospedantes (habitualmente células procariotas en la técnica anterior), tener una región susceptible a la inserción o sustitución de aminoácidos para crear nuevos sitios de unión, y tal inserción/sustitución de sitios de unión no debería de afectar al plegamiento del armazón.

Los armazones usados más habitualmente se basan en las regiones marco de cadenas de inmunoglobulinas o de “anticuerpos”. En particular, en la técnica anterior se ha usado el marco de Ig y/o versiones acortadas o fusionadas de él para presentar y constreñir geométricamente a los péptidos. Sin embargo, los anticuerpos son grandes, e incluso los fragmentos recombinantes son de tamaño considerable (por ejemplo, los fragmentos Fab tienen alrededor de 450aa, e incluso los fragmentos scFv tienen alrededor de 270aa). Esto los hace difíciles de manipular in vitro e in vivo. Además, comprenden dos cadenas polipeptídicas diferentes que son inestables en el sentido de disociación, oligomerización e incluso agregación a gran escala, lo que representa problemas adicionales asociados con su uso.

Los armazones de la técnica anterior han incluido nucleasa estafilocócica inactivada, proteína fluorescente verde (GFP) y tiorredoxina A (TrxA), así como plegamientos proteicos aislados tales como el dominio Z de la proteína A estafilocócica, “aficuerpos”, anticalinas, y repeticiones de anquirina. Otras proteínas de armazón de la técnica anterior incluyen el dominio de fibronectina tipo III (“Fn3”), las proteínas de la familia de lipocalina, de las que derivan las anticalinas, la proteína de unión a bilina (BBP), y otras. Los armazones para aptámeros peptídicos se describen en in Borghouts et al, Expert Opin. Biol. Ther. (2005) 5(6): 783-797.

Esta tecnología se ha llevado a cabo de la forma más activa usando tiorredoxina bacteriana (TrxA) como armazón. Sin embargo, hay problemas asociados con TrxA. Por ejemplo, la TrxA de E. coli puede inhibir la apoptosis, lo que puede conducir a observaciones que llevan a confusión en ensayos a base de células. También, los dos restos de cisteína que delimitan a los péptidos insertados, y que forman un enlace de disulfuro reversible en TrxA, pueden conducir a incertidumbre con respecto al estado “correcto” para la presentación del péptido activo.

La presente invención procura superar el problema o problemas asociados con la técnica anterior.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en una comprensión detallada de la biología molecular de la proteína Estefina A (algunas veces denominada como “cistatina A”). Esta comprensión ha permitido la modificación de la proteína SteA de tipo salvaje en una forma que la hace adecuada para uso como una proteína de armazón. Las proteínas de armazón a base de Estefina A tienen varias ventajas con respecto a los armazones de la técnica anterior.

Según la presente invención, la Estefina A se ha hecho de forma ventajosa biológicamente neutra. Como se explica con más detalle a continuación, se han introducido mutaciones racionales en sitios en el polipéptido de Estefina A que destruyen sus interacciones y actividades biológicamente significativas. Además, se ha escogido un sitio de inserción y se ha demostrado experimentalmente que es capaz de aceptar y constreñir péptidos insertados tales como los aptámeros peptídicos usados en algunos de los ejemplos más abajo. Además, los inventores han seleccionado racionalmente dos superficies de Estefina A expuestas a disolventes discretas adicionales, que proporcionan ventajosamente la oportunidad de seleccionar parejas de unión peptídica con mayor avidez y/o mayor especificidad por el péptido diana.

De este modo, la invención proporciona el uso de Estefina A como proteína de armazón, y proporciona polipéptidos de Estefina A modificados que son útiles como proteínas de armazón. Preferentemente, la Estefina A es una Estefina A humana.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que los aminoácidos 71 a 73 de la Estefina A son sustituidos por una inserción peptídica heteróloga.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende una mutación V48D.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende una mutación G4W.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende además las mutaciones V48D y G4W.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende la secuencia mostrada como SEC ID nº: 1. Esta es la secuencia de armazón mutante triple preferida.

En otro aspecto, la invención se refiere a un uso como se describe anteriormente, en el que la proteína de armazón comprende la secuencia mostrada como SEC ID nº: 3 y la secuencia mostrada como SEC ID nº: 4. Estas son las secuencias STM preferidas a cada lado de la inserción peptídica heteróloga.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº: 1. Esta es la secuencia STM mutante triple preferida.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº: 3 y la secuencia mostrada como SEC ID nº: 4. Estas son las secuencias STM preferidas a cada lado de la inserción peptídica heteróloga.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº: 1, o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº: 2, en la que se inserta un péptido heterólogo en el sitio Leu73. Preferentemente, el péptido heterólogo insertado en el sitio Leu73 suprime el resto de aminoácido Leu73.

Preferentemente, el péptido heterólogo comprende 36 aminoácidos o menos, preferentemente 20 aminoácidos o menos, preferentemente 12 o menos.

En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleotídica...

Reivindicaciones

1. Uso de Estefina A como una proteína de armazón, en el que la Estefina A es una Estefina A humana, y en el que los aminoácidos 71 a 73 de Estefina A están sustituidos por una inserción peptídica heteróloga.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la proteína de armazón comprende una mutación V48D, en la que V48 está sustituido con D.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína de armazón comprende una mutación G4W en la que G4 está sustituido con W.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que la proteína de armazón comprende además las mutaciones V48D y G4W, en las que V48 está sustituido con D y en la que G4 está sustituido con W.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de armazón comprende la secuencia MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVF y la secuencia PGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF.

6. Polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVF fusionada a una secuencia de aminoácidos heteróloga fusionada a la secuencia de aminoácidos PGQN EDLVLTGYQVDKNKDDELTGF.

7. Polipéptido que comprende

(i) la secuencia de aminoácidos MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVFNGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF; o

(ii) la secuencia de aminoácidos MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVFKSLPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF,

en el que los aminoácidos 71 a 73 están sustituidos por un péptido heterólogo.

8. Polipéptido según la reivindicación 7, en el que dicho péptido heterólogo comprende 20 aminoácidos o menos.

9. Polipéptido según la reivindicación 8, en el que dicho polipéptido heterólogo comprende 12 aminoácidos o menos.

10. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de armazón o polipéptido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Polipéptido que comprende la secuencia MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVFNGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF.

12. Ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos MIPWGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVDAGTNYYIKVRAGDNK YMHLKVFNGPPGQNEDLVLTGYQVDKNKDELTGF.

13. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 12, en el que la secuencia nucleotídica comprende un sitio de restricción RsrII.

14. Método para identificar un péptido diana capaz de unirse a una estructura de interés, que comprende

(i) proporcionar una proteína de armazón de estefina A que comprende un péptido diana que sustituye a los aminoácidos 71 a 73 de estefina A;

(ii) poner en contacto dicha proteína de armazón con dicha estructura de interés; y

(iii) monitorizar la asociación entre el armazón y la estructura de interés;

en el que la asociación de la proteína de armazón con la estructura de interés identifica el péptido diana como un péptido diana candidato capaz de unirse a dicha estructura.