PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE UN FACTOR INMUNOGENO DE CORYNEBACTERIUM DIPHTERIAE USANDO UN MEDIO DE CULTIVO CON EXTRACTO DE LEVADURA COMO FUENTE DE AMINOACIDOS Y SIN COMPLEJOS PROTEICOS DE ORIGEN ANIMAL.

Un procedimiento para la preparación de un factor inmunógeno de una bacteria patógena que comprende las etapas de:

a) cultivo de Corynebacterium diphtheriae en un medio que comprende al menos 20% en peso seco de un material proteínico de procedencia no animal, y el cual no comprende material proteínico de procedencia animal, en el que el material proteínico de procedencia no animal es un extracto de levadura; y b) purificación del factor inmunógeno a partir del medio

La presente invención se refiere a un medio para el cultivo de bacterias patógenas. La presente invención se refiere también al uso de un medio para el cultivo de bacterias patógenas, la obtención de factores inmunógenos a partir de las bacterias que han sido cultivadas y la preparación de vacunas que usan los factores inmunógenos. 5

Las vacunas bacterianas se producen mediante el cultivo de bacterias patógenas en un medio, el aislamiento de los factores inmunógenos y la preparación de vacunas basadas en los factores inmunógenos aislados. Dichos procedimientos se describen en Bacterial Vaccines, (1984), Ed. Rene Germanier Academic Press y en “Bacterial Vaccines” en Advances in Biotechnology Processes, vol. 13, (1990), Ed. A. Mizrahi, Wiley-Liss. En los procedimientos 10 convencionales, las bacterias patógenas se cultivan en medios que contienen material proteínico de origen animal. Estos compuestos se usan en la creencia de que algunos factores de desarrollo, esenciales para el desarrollo de bacterias patógenas, han estado únicamente presentes en compuestos de origen animal tales como sangre, infusión de corazón y cerebro, carne, etc. Por ejemplo, el C. tetani se desarrolla en medios que contienen una infusión de 15 corazón y un digesto enzimático de caseína; el C. diphtheriae requiere una infusión de vaca; el H. pylori se desarrolla en medios que contienen peptamina y triptona; y el Haemophilus influenzae se desarrolla en medios que contienen proteosa peptonas. El informe de la Organización Mundial de la Salud números de serie 800 (1990) y 814 (1991) indica que para el desarrollo de Haemophilus influenza, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani y 20 Bordetella pertussis, se requieren medios que comprendan compuestos de origen animal.

La exigencia de material proteínico de origen animal en los medios provoca inquietud sobre la posible contaminación de los medios. En particular, inquieta el que los medios puedan estar contaminados con el agente causante de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) u otros agentes infecciosos y perjudiciales, que restrinjan la utilidad de cualquiera de los 25 factores obtenidos de dichos cultivos, especialmente en aplicaciones terapéuticas.

De manera sorprendente, se ha encontrado que materiales proteínicos de origen no animal son capaces de sostener el desarrollo de bacterias patógenas y facilitan la producción de factores inmunógenos por las bacterias.

El documento WO 94/09115 describe un procedimiento de cultivo de Streptococcus 30 pneumoniae en un medio de cultivo que contiene componentes animales no complejos.

En la solicitud de patente DD 294 502-A, se describe un procedimiento para la preparación de hidrolizados de soja y el uso de los hidrolizados de soja en el cultivo de microorganismos para fimbrias. El hidrolizado de soja se prepara cultivando medio que contiene harina de soja con cepas de estreptomices. El hidrolizado de soja se usa como una 35 fuente de carbono debido al alto porcentaje de polisacáridos presentes y contiene menos del 20% de peso en seco de proteína.

El uso de material proteínico de origen no animal, tal como proteínas procedentes de soja, semillas de algodón, patatas, etc., como un medio constitutivo para el cultivo de bacterias patógenas, elimina completamente el riesgo de contaminación procedente de animales, tal 5 como la BSE, de ser transmitida a los humanos en cualquiera de las aplicaciones terapéuticas o profilácticas posteriores.

Una ventaja adicional asociada con el uso de materiales proteínicos procedentes de vegetales es la reducción en el costo de producción de los materiales y el incremento de consistencia en los materiales (el material proteínico procedente de no animales es más 10 uniforme en su composición que los materiales procedentes de animales).

La presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de un factor inmunógeno de una bacteria patógena que comprende las etapas de: a) cultivo de Corynebacterium diphtheriae en un medio que comprende al menos 20% en peso seco de un material proteínico de procedencia no animal, y el cual no comprende material proteínico de 15 procedencia animal, en el que el material proteínico de procedencia no animal es un extracto de levadura; y b) purificación del factor inmunógeno a partir del medio.

Puede usarse cualquier medio convencional para el cultivo de bacterias como la base para el medio, siempre y cuando que el medio no contenga material proteínico procedente de animales. 20

Preferiblemente, el medio usado en la presente invención comprende una fuente de carbono y energía, una fuente de nitrógeno, sales esenciales y opcionalmente un agente selectivo, tal como un antibiótico, para la selección de los microorganismos a cultivar.

El medio usado en la presente invención puede ser un medio sólido o líquido. Los ejemplos de medios líquidos convencionales que pueden formar la base del medio usado en la 25 presente invención incluyen caldo de Brucella (sin triptona y peptamina), medio de Watson (sin casaminoácidos), medio de Mueller Miller (sin infusión de corazón e hidrolizado de caseína), medio de CL (sin casaminoácidos) y medio de Franz A. Los medios sólidos convencionales pueden prepararse a partir de cualquiera de los medios líquidos mediante la adición de un agente solidificante tal como agar. 30

El término “cultivo” tal como se usa aquí, significa el mantenimiento, y preferiblemente el desarrollo, de bacterias. El desarrollo bacteriano se define aquí como un incremento en la biomasa bacteriana.

El término “bacteria patógena” tal como se usa aquí, significa cualquier bacteria que esté implicada en la patogénesis de una enfermedad. La bacteria patógena usada en la 35 presente invención es Corynebacterium diphtheriae.

El término “factor inmunógeno” tal como se usa aquí, significa cualquier factor que es capaz de estimular el sistema inmune de un humano o animal. Dichos factores inmunógenos incluyen proteínas antígenas y especialmente factores de virulencia y fragmentos de los mismos. Los factores de virulencia se definen como los asociados con la virulencia de una 5 bacteria e incluyen factores tales como la citotoxina VacA vacuolante producida por Helicobacter pylori. Otros factores virulentos han sido descritos por Rappuoli, R. y otros, en European Journal of Gastroenterology and Hepatology of Helicobacter pylori infection. Proceedings of an interdisciplinary meeting (Genova, Junio 18-19, 1993) J.J. Misiewicz, Ed. (CS Current Science), págs. S76-S78. El factor inmunógeno puede estar genéticamente 10 destoxificado o tratado mediante un procedimiento de toxoidización. Los procedimientos para la destoxificación genétca y los factores inmunógenos toxoidizantes son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen los descritos por Rappuoli, R., Vaccine, vol. 12, págs. 579-581, (1994).

El término “material proteínico”, tal como se usa aquí, significa proteínas y productos de 15 degradación de proteínas incluyendo aminoácidos libres. Preferiblemente, el material proteínico es un hidrolizado de proteína.

Los materiales proteínicos procedentes de no animales tal como se usan aquí, significan materiales proteínaceos procedentes de fuentes no mamíferas, tales como vegetales, aves, peces, levaduras, hongos, algas y microorganismos. Más preferiblemente, materiales 20 proteínicos procedentes de no animales significan materiales proteínaceos procedentes de vegetales, levaduras, algas y microorganismos. Lo más preferiblemente, materiales proteínicos procedentes de no animales significan materiales proteínaceos procedentes de vegetales tales como composiciones proteicas procedentes de soja, semillas de algodón, patatas, etc.

El medio usado en la presente invención comprende al menos 20% en peso seco de un 25 material proteínico procedente de no animales que es un extracto de levadura tal como HY YEST (Quest). Otros materiales proteínicos derivados de no animales que se pueden incluir adicionalmente en un medio usado en la presente invención son composiciones de proteína procedentes de soja tales como Hysoy (Quest), Amisoy (Quest), N-Z soy (Quest) y Soytone (Difco). 30

Los extractos de levadura se pueden preparar mediante procedimientos convencionales bien conocidos por los especialistas en la técnica. Además los extractos de levadura se encuentran comercialmente disponibles de numerosas fuentes incluyendo Sigma y Quest.

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1. Un procedimiento para la preparación de un factor inmunógeno de una bacteria patógena que comprende las etapas de:

a) cultivo de Corynebacterium diphtheriae en un medio que comprende al menos 20% 5 en peso seco de un material proteínico de procedencia no animal, y el cual no comprende material proteínico de procedencia animal, en el que el material proteínico de procedencia no animal es un extracto de levadura; y

b) purificación del factor inmunógeno a partir del medio.

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2. Un procedimiento para la producción de una vacuna que comprende la preparación de un factor inmunógeno de una bacteria patógena mediante el procedimiento de la reivindicación 1, y la asociación de dicho factor, opcionalmente toxoidado, con un vehículo aceptable farmacéuticamente.