TERAPIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA EL CÁNCER DE PÁNCREAS.

Anticuerpo monoclonal recombinante aislado que comprende dos componentes de cadena ligera y dos componentes de cadena pesada,

en el que cada uno de dichos componentes de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 4 (SEQ ID NO: 6) y cada uno de dichos componentes de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 2 (SEQ ID NO: 3), y en el que dicho anticuerpo presenta actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) específica para células cancerosas de colon y de páncreas, siendo dicho anticuerpo monoclonal recombinante aislado para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas

1. INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere al uso del anticuerpo monoclonal 31.1 y sus equivalentes y anticuerpos coespecíficos en el tratamiento y el diagnóstico del cáncer de páncreas. Se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que el anticuerpo monoclonal 31.1 es reactivo con células de páncreas malignas, pero no con las no malignas. La presente memoria descriptiva da a conocer además secuencias de polinucleótidos y aminoácidos que comprenden la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de Mu-31.1 tal como se expone en la figura 2 y la figura 4, respectivamente. Tales secuencias de polinucleótidos pueden usarse para expresar de manera recombinante anticuerpos equivalentes a 31.1 para su uso en los procedimientos de la invención.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

2.1. CÁNCER DE PÁNCREAS

El cáncer de páncreas es la quinta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos, esperándose que este año mueran aproximadamente 28.000 estadounidenses por la enfermedad (sitio web sobre el cáncer de páncreas, The Johns Hopkins Medical Institutions, http://162.129.03.69:80/PANCREAS_INTRO). En la actualidad, el único tratamiento potencialmente curativo es la extracción quirúrgica del cáncer, en el contexto de un procedimiento extenso y complejo que extrae la cabeza, el cuello y el proceso unciforme del páncreas así como la mayor parte del duodeno (la “operación Whipple”). Sin el tratamiento, la tasa supervivencia global a 5 años es sólo del 3 por ciento (Id.).

La quimioterapia (que usa a menudo gemcitabina (Gemzar®)) y terapia con radiación son los tratamientos principales ofrecidos a los pacientes con tumores no reseccionables (Id.). Actualmente está estudiándose una inmunoterapia experimental en la que se modifican genéticamente las propias células de un paciente para expresar la proteína inmunoestimuladora, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, se irradian para evitar el crecimiento tumoral, y entonces se introducen de nuevo al paciente, en el que se espera que éstas estimulen una respuesta inmunitaria (1997, Cancer Res. 57:1537-1546; sitio web sobre el cáncer de páncreas, The Johns Hopkins Medical Institutions, http://162.129.103.69:80/PANCREAS_MEDICAL_TX)).

2.2. ANTICUERPO MONOCLONAL 31.1

El anticuerpo 31.1 representa un anticuerpo monoclonal dirigido a proteínas derivado mediante la inmunización de ratones BALB(c) con una preparación de membrana obtenida de muestras de carcinoma de colon alogénicas (humanas) combinadas. Se fragmentaron las células usadas para preparar el antígeno usando una bomba de nitrógeno (Parr) y entonces se sometieron a ultracentrifugación. Inicialmente se sometió a prueba el material de membrana mediante microscopía electrónica para garantizar la compatibilidad entre lotes, descartando los componentes citoplasmáticos y nucleares. Después, se sonicó y fraccionó con Sephadex G200. Se usó electroforesis en gel de poliacrilamida discontinua para la purificación parcial inicial (aproximadamente el 80%) y se sometieron a prueba 30 g para detectar hipersensibilidad cutánea retrasada (DHR), (3). Se inmunizaron los ratones BALB mediante inyección intraperitoneal de 50 microgramos de antígeno asociado a carcinoma de colon. Se proporcionó una segunda inyección 10 días después y luego se sacrificaron los ratones para obtener células del bazo para la fusión. Se realizó la fusión incubando 5x107 células de bazo de ratón con 107 células de mieloma sp2/0AG 14 en PEG al 40%. Se ha demostrado que el antígeno definido por el anticuerpo monoclonal 31.1 tiene un PM de 72.000. Estudios que usan la inmunoperoxidasa han sugerido que se observa con mayor frecuencia el antígeno reconocido por 31.1 en los tumores de colon de grado superior. La especificidad para el anticuerpo es alta de modo que en un estudio de colonocitos eliminados en la clínica Mayo, la sensibilidad y especificidad fueron superiores cuando se compararon con anticuerpos anti-CEA, anti-MUC1 y B72.3.

Se aislaron varios anticuerpos candidatos y se sometieron a prueba a partir de la primera generación de TAA. Todos demostraron ser derivados proteicos y relativamente específicos para el carcinoma de colon. El anticuerpo 31.1 correspondió a uno de dos antígenos que se ha demostrado que migran estrechamente en la electroforesis en gel y se relacionan con la glicoproteína inmunogénica que induce DHR. La versión murina es de isotipo IgG2a que se convierte a un isotipo IgG1 en la quimerización. Se encontró que 31.1 tiene fuertes índices de localización. Como tal, este anticuerpo fue el primero que se quimerizó.

Para la quimerización del anticuerpo monoclonal 31.1, se sometió a corte y empalme el exón que codifica para la proteína del gen de región variable de cadena pesada de 31.1 con los exones que codifican para proteína de la región constante de cadena gamma 1 humana. Se empleó PCR. Se amplificó el ADNc de VH de 31.1 mediante la PCR usando los cebadores inversos degenerados sintetizados basándose en las secuencias de ADN de la primera región de entramado (FR1) consenso y un cebador directo sintetizado según las secuencias de ADN de la región de unión J-C consenso. Se clonó el ADN de VH de 31.1 amplificado en el vector pBluescript y se secuenció. Se produjo

31.1 quimérico transfectando células SP2/0AG14 con el vector.

El anticuerpo monoclonal 31.1 y una versión quimérica (humanizada) de ese anticuerpo se describen en la patente estadounidense n.º 5.688.657 expedida el 18 de noviembre de 1997, en la actualidad objeto de una solicitud de reexpedición. Además, el anticuerpo monoclonal 31.1 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (“ATCC”), que tiene una dirección en 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209 y se le asignó el número de registro ATCC PTA-2497 y se ha depositado la versión quimerizada en la ATCC y se le asignó el número de registro 12316.

3. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones. Se refiere al uso de equivalentes de unión del anticuerpo monoclonal 31.1, incluyendo versiones quimerizadas y/o humanizadas de los mismos, fragmentos de anticuerpos y anticuerpos que se unen de manera competitiva y fragmentos de anticuerpos, así como anticuerpos, derivados y fragmentos coespecíficos en el tratamiento y diagnóstico del cáncer de páncreas.

Se basa, al menos en parte, en estudios in vitro usando tanto versiones murinas como quiméricas de 31.1 que compararon las actividades ADCC de los anticuerpos 31.1 con D6-12 y 17.1a (Panorex). Mientras que la versión murina de 31.1 puede inducir una de respuesta de ADCC del 35%, se ha mostrado que la versión quimérica da como resultado la destrucción del 80% de células tumorales cada tres horas, usando un ensayo de liberación de cromo. Esto se compara con la tasa del 30% de destrucción asociada con D6-12 y una tasa del 15% para Panorex. Usando modelos de xenoinjerto con líneas celulares de cáncer de colon humanas LC-174T y Colo205, se encontró que 31.1 quimérico provocaba la regresión de líneas tumorales establecidas (moléculas bien definidas) tras inocular dos millones de células tumorales en las patas traseras de ratones desnudos y administrar anticuerpo intraperitoneal a los 10 días junto con células efectoras humanas. A los 30 días, el volumen del tumor en los animales tratados en comparación con los controles se redujo en más del 95%. Pueden esperarse resultados similares cuando se dirige el anticuerpo hacia células cancerosas de páncreas, ya que se ha demostrado que el anticuerpo 31.1 se une al antígeno presente en células cancerosas de páncreas, pero no a tejidos de páncreas no malignos.

La presente memoria da a conocer secuencias de polinucleótidos y aminoácidos que comprenden la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de Mu-31.1 que pueden usarse para expresar anticuerpos 31.1 quimerizados. Estas secuencias de nucleótidos incluyen: (a) las secuencias de nucleótidos mostradas en la figura 2 o la figura 4; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 o la figura 4; y (c) cualquier secuencia de nucleótidos que (i) se une a la secuencia de nucleótidos de la figura 2 o la figura 4 en condiciones de hibridación rigurosas, por ejemplo, hibridación a ADN unido a filtro en NaHPO4 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65º, y lavado en 0,1xSSC/SDS al 0,1% a 68º y (ii) codifica para una región variable de cadena ligera y pesada que puede... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal recombinante aislado que comprende dos componentes de cadena ligera y dos componentes de cadena pesada, en el que cada uno de dichos componentes de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 4 (SEQ ID NO: 6) y cada uno de dichos componentes de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 2 (SEQ ID NO: 3), y en el que dicho anticuerpo presenta actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) específica para células cancerosas de colon y de páncreas, siendo dicho anticuerpo monoclonal recombinante aislado para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas.

2. Kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1.

10 3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo está marcado.

4. Anticuerpo quimérico que comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo recombinante tal como se describe en la reivindicación 1 unidas a secuencias de inmunoglobulina de región constante humana, siendo dicho anticuerpo quimérico para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas.

15 5. Kit de diagnóstico que comprende el anticuerpo según la reivindicación 4.

6. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo está marcado.

7. Uso del anticuerpo según la reivindicación 1 ó 4 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de páncreas

8. Procedimiento de diagnóstico de cáncer de páncreas en un sujeto, que comprende poner en contacto una

20 muestra biológica del sujeto con el anticuerpo según la reivindicación 1 ó 4 en condiciones tales que puede producirse una reacción antígeno-anticuerpo inmunoespecífica, y detectar o medir la cantidad de cualquier unión inmunoespecífica mediante el anticuerpo.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el anticuerpo está marcado.