PROTEÍNAS DE FUSIÓN ANÁLOGAS DE GLP-1.

La presente invención se refiere a análogos del péptido símil glucagón fusionado a proteínas que tienen el efecto de extender la semivida in vivo de los péptidos. Estas proteínas de fusión pueden utilizarse para tratar la diabetes así como una variedad de otras condiciones o trastornos. Los análogos y derivados del péptido 1 símil glucagón (GLP-1) son prometedores en ensayos clínicos para el tratamiento de la diabetes tipo 2. GLP-1 induce numerosos efectos biológicos, como estimulación de la secreción de insulina, inhibición de la secreción de glucagón, inhibición del vaciamiento gástrico, inhibición de la motilidad gástrica o de la motilidad intestinal, e inducción de pérdida de peso. Una característica significativa de GLP-1 es su capacidad para estimular la secreción de insulina, sin el riesgo asociado de hipoglucemia que se observa cuando se utiliza la terapia con insulina o algunos tipos de terapias orales que actúan aumentando la expresión de insulina. La utilidad de la terapia que implican péptidos GLP-1 se ha visto limitada por el hecho de que GLP-1(1-37) no es muy activo, y los dos péptidos truncados naturales, GLP-1(7-37)OH y GLP-1(7-36) NH2, se eliminan rápidamente in vivo y tienen semividas in vivo extremadamente cortas. Se sabe que la dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV) producida en forma endógena inactiva péptidos GLP-1 circulantes mediante la eliminación de residuos de histidina y alanina Nterminales y es una razón importante para la semivida corta in vivo. Se han realizado diversas estrategias para extender la semivida de eliminación de un péptido GLP-1 o reducir el aclaramiento del péptido del organismo mientras se mantiene la actividad biológica. Una estrategia implica la fusión de un péptido GLP-1 a la porción Fc de una inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas circulantes suelen tener semividas largas in vivo. Por ejemplo, las moléculas de IgG puede tener una semivida en seres humanos de hasta 23 días. La porción Fc de la inmunoglobulina es responsable, en parte, por esta estabilidad in vivo. Las proteínas de fusión GLP-1-Fc toman ventaja de la estabilidad proporcionada por la porción Fc de una inmunoglobulina mientras se preserva la actividad biológica de la molécula de GLP-1. En este sentido el documento WO 02/46227 desvela fusiones de un compuesto GLP-1 y una inmunoglobulina, como IgG1 o IgG4. El documento WO 96/04388 desvela fusiones de un IL-4 mutante o variante y al menos un dominio constante de una inmunoglobulina humana o un fragmento de la misma. Aunque esta estrategia es factible para tratamientos con GLP-1 (Véase el documento WO 02/46227), existe una preocupación general con respecto a la antigenicidad de diversas proteínas de fusión cuando se administran en repetidas ocasiones durante períodos prolongados de tiempo. Esta es una preocupación especialmente para los tratamientos con GLP-1-Fc ya que un paciente con diabetes debe ser tratado durante toda su vida una vez diagnosticada la enfermedad. Además, los tratamientos con proteínas de fusión con Fc pueden ser un problema si la porción Fc conserva funciones efectoras no deseadas. La presente invención busca superar los problemas asociados con la inmunogenicidad y la actividad efectora potenciales asociadas con la administración de fusiones GLP-1-Fc mediante la identificación de proteínas de fusión GLP-1-Fc específicas que tienen menor riesgo de inducir una respuesta inmune después de la administración repetida y prolongada y que ya no tienen función efectora. Estas proteínas de fusión específicas tienen sustituciones en diferentes posiciones en la porción GLP-1 así como en la porción Fc de la molécula. Las sustituciones descritas en la presente memoria proporcionan mayor potencia, mayor estabilidad in vivo, eliminación de la función efectora y disminución de la probabilidad de que la molécula será reconocida por los elementos adaptativos del sistema inmunológico. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporcionan proteínas de fusión heterólogas que comprenden un análogo de GLP-1 que comprende una secuencia seleccionada de: a)   en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; 2 b) en la que Xaa8 Gly se selecciona de y Val; c) en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; d) en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; e) en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; f)   en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; fusionada con la porción Fc de una inmunoglobulina que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7 Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu- Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu- Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe- Xaa80-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val- Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu- Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala- Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe- Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu- His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa230 (SEQ ID NO:7) en la que: Xaa en la posición 16 es Pro o Glu; 3 Xaa en la posición 17 es Phe, Val o Ala; Xaa en la posición 18 es Leu, Glu, o Ala; Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente. El residuo de glicina C-terminal del análogo de GLP-1 está fusionado preferentemente al residuo de alanina N- terminal de la porción Fc a través de un conector peptídico que comprende una secuencia seleccionada de: a) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:8); b) Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:19); y   c) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:21). El conector comprende más preferentemente la secuencia de SEQ ID NO: 8. Preferentemente, Xaa en la posición 8 del análogo de GLP-1 de la presente invención es Gly o Val. Aún más preferentemente el análogo de GLP-1 de la presente invención comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. La proteína de fusión heteróloga de la presente invención se selecciona de: a) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P); b) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); c) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, N297A); d) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP- 1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P); f) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); g) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 - GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, N297A); h) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); i) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P); j) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); k) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, N297A); 1) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); y las formas des-K de los mismos. Una proteína de fusión heteróloga preferida es la forma des-K de Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A). Más preferentemente la proteína de fusión heteróloga se selecciona de: a) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P); b) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); c) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, N297A); d) Val 8 -Glu 22 -Gly 6 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP- 1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P); f) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1.5L-1gG4 (S228P, F234A, L235A); g) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 - GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, N297A); h) Val 8 -Glu 22 -Gly 6 -GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); i) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P); j) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); k) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, N297A); 1) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); y las formas des-K de los mismos. Una proteína de fusion heteróloga preferida comprende (a) un análogo de GLP-1 que comprende la SEQ ID NO:1 His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys-Gly-Gly-Gly en la que Xaa8 se selecciona de Gly; (b) una porción Fc de una inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO:7 Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu- Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión heteróloga que comprende un análogo de GLP-1 que comprende una secuencia seleccionada de: a) en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; b) en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; c) en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; d) en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; e) en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; f)   en la que Xaa8 se selecciona de Gly y Val; fusionada a la porción Fc de una inmunoglobulina que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7 29   en la que: Xaa en la posición 16 es Pro o Glu; Xaa en la posición 17 es Phe, Val o Ala; Xaa en la posición 18 es Leu, Glu, o Ala; Xaa en la posición 80 es Asn o Ala; y Xaa en la posición 230 es Lys o está ausente. 2. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 1 en la que el residuo de glicina C-terminal del análogo de GLP-1 está fusionado al residuo de alanina N-terminal de la porción Fc a través de un conector péptido que comprende una secuencia seleccionada de: a) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:8); 3. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 2 en la que el conector comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8. 4. La proteína de fusión heteróloga de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que Xaa en la posición 8 del análogo de GLP-1 es Gly. 5. La proteína de fusión heteróloga de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que Xaa en la posición 8 del análogo de GLP-1 es Val. 6. La proteína de fusión heteróloga de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que el análogo de GLP-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.   7. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 1 en la que la proteína de fusión heteróloga se selecciona de: a) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P); b) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); c) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, N297A); d) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e) Gly-Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P); f) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); g) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, N297A); h) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7- 37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); i) Gly 8 -G1u22-G1y36-GLP-1(7-37)-2LIgG4 (S228P); j) Gly-Glu 22 - Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); k) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)- 2L-IgG4 (S228P, N297A); 1) Gly 8 -Glu 22 -Gly 36 -Gly 36 -1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); y las formas des-K de los mismos. 8. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 7 en la que la proteína de fusión es la forma des-K de Gly 8 - Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A). 9. La proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 1 en la que la proteína de fusión heteróloga se selecciona de: a) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P); b) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); c) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, N297A); d) Val 8 -GLu 22 -GLy 36 -GLP-1(7-37)-IL-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P); f) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); g) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, N297A); h) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7- 37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); i) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2LIgG4 (S228P); j) Val 8 -Glu 22 -Gly 36 - GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A); k) Val 8 -GLu22-GLy36-GLP-1 (7-37)-2L-IgG4 (S228P, N297A); 1) VaL8-Glu 22 -Gly 36 -GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); y las formas des-K de los mismos. 10. La proteína de fusión heteróloga de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: (a) un análogo de GLP-1 que comprende la SEQ ID NO: 1 His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser- Tyr-Leu- Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-GLy en la que Xaa8 se selecciona de Gly; (b) una porción Fc de una inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 7 en la que: Xaa en la posición 16 es Glu; Xaa en la posición 17 es Ala; Xaa en la posición 18 es Ala; Xaa en la posición 80 es Asn; y Xaa en la posición 230 está ausente; y 31   (c) un conector péptido que comprende la SEQ ID NO: 8 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, en el que la glicina N-terminal del conector péptido está fusionada directamente con el residuo de glicina Cterminal del análogo de GLP-1 y la serina C-terminal del conector péptido está fusionada directamente a la alanina N-terminal de la porción Fc. 11. La proteína de fusión heteróloga de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende la secuencia de aminoácidos: 12. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión heteróloga de la reivindicación 11. 13. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 12, en la que dicha secuencia comprende la SEQ ID NO: 20. 14. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso como un medicamento. 15. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus no dependiente de insulina. 16. La proteína de fusión heteróloga de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento de la obesidad o la inducción de pérdida de peso en un individuo con sobrepeso. 17. Un dímero que comprende dos proteínas de fusión heterólogas de acuerdo con la reivindicación 11. 18. Una formulación que comprende una cualquiera de las proteínas de fusión heterólogas de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11. 19. Una formulación que comprende el dímero de acuerdo con la reivindicación 17. 32