PROTEÍNA DE UNIÓN A RECEPTOR NOGO.

Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido soluble, donde:

(A) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido seleccionado del siguiente grupo, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo: (a) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-532 de la SEC ID Nº 2; (b) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-417 de la SEC ID Nº 2; (c) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-432 de la SEC ID Nº 2; (d) un polipéptido que comprende los aminoácidos 417-531 de la SEC ID Nº 2; (e) un polipéptido que comprende los aminoácidos 425-531 de la SEC ID Nº 2; (f) un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-531 de la SEC ID Nº 2; (g) un polipéptido que comprende los aminoácidos 433-493 de la SEC ID Nº 2; (h) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2 C-terminal al dominio LRR, y un dominio de inmunoglobulina (Ig) de la SEC ID Nº 2 C-terminal a la región básica; (i) un polipéptido que comprende un dominio de Ig de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático; (j) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio de Ig de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático; y (k) un polipéptido como en (h), que carece de un dominio citoplasmático; donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de unirse a NgR1 para aliviar la inhibición mediada por NgR1 de la extensión axonal en una neurona del sistema nervioso central; (B) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido que incluye el siguiente motivo de aminoácidos, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo: LSPRKH (SEC ID Nº 10); donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1; o (C) dicho polipéptido soluble consiste en el siguiente polipéptido, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo: LSPRKH (SEC ID Nº 10); donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1

Campo de la Invención

Esta invención se refiere a la neurología, neurobiología y la biología molecular. Más particularmente, esta invención se refiere a moléculas y medicamentos para el tratamiento de enfermedades, trastornos y lesiones neurológicas tales como 5 lesión de la médula espinal.

Antecedentes de la Invención

Los axones y las dendritas se extienden desde las neuronas. La punta distal de un axón o neurita extensible incluye una región especializada, conocida como cono de crecimiento. Los conos de crecimiento detectar el entorno local y guían el crecimiento axonal hacia una célula diana de la neurona. Los conos de crecimiento responden a indicios 10 ambientales, por ejemplo, adhesividad superficial, factores de crecimiento, neurotransmisores y campos eléctricos. Los conos de crecimiento generalmente avanzan a una velocidad de uno a dos milímetros por día. El cono de crecimiento explora el área delante del mismo y a cada lado, mediante elongaciones clasificadas como lamelipodios y filopodios. Cuando una elongación contacta con una superficie desfavorable, se repliega. Cuando una elongación contacta con una superficie de crecimiento favorable, continúa extendiéndose y guía el cono de crecimiento en esa dirección. Cuando el 15 cono de crecimiento alcanza una célula diana apropiada se crea una conexión sináptica.

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La función de las células nerviosas está influida por el contacto entre neuronas y otras células en su entorno inmediato (Rutishauser, et al., 1988, Physiol. Rev. 68:819). Estas células incluyen células de la glía especializadas, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (SNC), y células de Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP), que envainan el axón neuronal con mielina (Lemke, 1992, en An Introduction to Molecular Neurobiology, Z. Hall, Ed., 20 pág. 281, Sinauer).

Las neuronas del SNC tienen el potencial inherente de regenerarse después de una lesión, pero están inhibidas para hacer eso por proteínas inhibidoras presentes en la mielina (Brittis et al., 2001, Neuron 30:11-14; Jones et al., 2002, J. Neurosci. 22:2792-2803; Grimpe et al., 2002, J. Neurosci.: 22:3144-3160).

Se han caracterizado varias proteínas inhibidoras de mielina en los oligodendrocitos. Los ejemplos conocidos de 25 proteínas inhibidoras mielina incluyen NogoA (Chen et al., Nature, 2000, 403, 434-439; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444), la glucoproteína asociada a mielina (MAG) (McKerracher et al., 1994, Neuron 13:805-811; Mukhopadhyay et al., 1994, Neuron 13:757-767) y la glucoproteína de oligodendrocitos (OM-gp), Mikol et al., 1988, J. Cell. Biol.106:1273-1279). Cada una de estas proteínas ha demostrado por separado que es un ligando para el NgR1 neuronal (Wang et al., Nature 2002, 417, 941-944; Grandpre et al., Nature 2000, 403, 439-444; Chen et al., Nature, 30 2000, 403, 434-439; Domeniconi et al., Neuron 2002, publicado online, 28 de junio de 2002).

El receptor-1 de Nogo (NgR1) es una proteína de membrana anclada a GPI que contiene 8 repeticiones ricas en leucina (Fournier et al., 2001, Nature 409:341-346). Tras la interacción con proteínas inhibidoras (por ejemplo, NogoA, MAG y OM-gp), el complejo NgR1 transduce señales que conducen a que el cono de crecimiento se contraiga y a la inhibición de la extensión de la neurita. 35

Existe una necesidad insatisfecha de moléculas y métodos para inhibir el colapso del cono de crecimiento mediada por NgR1 y la inhibición resultante de la extensión de la neurita.

Descripción resumida de la Invención

Se han hecho varios descubrimientos respecto al polipéptido denominado "Sp35" (nuestra denominación). Denominaciones alternativas para Sp35 incluyen "LINGO" y "LINGO-1". Estos descubrimientos incluyen los siguientes. 40 Sp35 se une a NgR1. Sp35 se une a sí misma en una interacción homotípica. Una proteína de fusión Sp35-Fc induce o promueve la fasciculación en neuronas granulares. Una proteína de fusión Sp35-Fc promueve la supervivencia neuronal tanto en el modelo de lesión de la hemisección del conducto rubro-espinal como en el modelo de transección del nervio óptico. Células primarias corticales infectadas con retrovirus Sp35, cuando se suministran a ratas con la médula espinal lesionada, provocan supervivencia neuronal potenciada, tinción aumentada en tubulina B III de los axones, y contenido 45 aumentado de mielina.

En base, en parte, a estos descubrimientos, la presente descripción caracteriza un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido en el que: (a) el polipéptido incluye (i) un dominio LRR de Sp35, (ii) una región básica de Sp35 C-terminal al dominio LRR, y (iii) un dominio de inmunoglobulina (Ig) de Sp35 C-terminal a la región básica; y (b) el polipéptido carece de un dominio transmembrana. El dominio LRR de Sp35 puede contener 50 un LRR carboxi-terminal (LRRCT), un LRR amino-terminal (LRRNT), o ambos. En algunos casos de la descripción, el polipéptido Sp35 codificado carece del dominio citoplasmático. En algunos casos, el polipéptido Sp35 codificado incluye los restos aminoacídicos 34-532 de la SEC ID Nº 2 y carece de los restos aminoacídicos 533-614.

La presente descripción también incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido donde el polipéptido incluye un dominio Ig de Sp35 y carece de un dominio LRR de Sp35, una región básica de Sp35, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático.

La presente descripción también incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido donde el polipéptido incluye un dominio LRR de Sp35 y carece de un dominio Ig de Sp35, una región básica de Sp35, un dominio transmembrana, y un 5 dominio citoplasmático.

La presente descripción también incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido que carece de un dominio citoplasmático funcional pero que incluye todos los demás dominios de Sp35. Por ejemplo, el polipéptido codificado podría incluir los aminoácidos 1-576 de la SEC ID Nº 2 (antes del procesamiento de la secuencia señal).

En algunos casos de la descripción, el polipéptido codificado es un polipéptido de fusión que contiene un motivo no de 10 Sp35. El motivo de no Sp35 puede ser, por ejemplo, un motivo de Ig, un motivo de albúmina sérica, un motivo de dirección, un motivo informador, o un motivo que facilita la purificación. Un motivo no de Sp35 preferido es un motivo de Ig, por ejemplo, un motivo Fc.

La secuencia nucleotídica puede estar unida de forma funcional a una secuencia de control de la expresión, por ejemplo, en un vector de expresión. La presente descripción también incluye una célula hospedadora transformada con 15 un vector que expresa un polipéptido Sp35 de la descripción.

La presente descripción también incluye un polipéptido Sp35 codificado por cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente.

La presente descripción también incluye un polipéptido Sp35 conjugado con un polímero, por ejemplo, un polialquilenglicol, un polímero de azúcar, y un polipéptido. Un polímero preferido es un polialquilenglicol, por ejemplo, 20 polietilenglicol (PEG). El polipéptido puede conjugarse a 1, 2, 3 ó 4 polímeros. Preferiblemente, el peso molecular total de los polímeros conjugados es de 20.000 Da a 40.000 Da por polipéptido Sp35.

La presente descripción también incluye un método para inhibir la transducción de señales por NgR1. El método incluye poner en contacto el NgR1 con una cantidad eficaz de un polipéptido Sp35. Los polipéptidos preferidos para su uso en el método incluyen los siguientes: 25

(a) un polipéptido Sp35, donde: (a) el polipéptido incluye (i) un dominio LRR de Sp35, (ii) una región básica de Sp35 C-terminal al dominio LRR, y (iii) un dominio de inmunoglobulina (Ig) de Sp35 C-terminal a la región básica; y (b) el polipéptido carece de un dominio transmembrana; y

(b) un polipéptido Sp35 que incluye un dominio Ig de Sp35 y carece de un dominio LRR de Sp35, una región básica de Sp35, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático. 30

La presente descripción también incluye un método para disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona...

1.Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido soluble, donde:

(A) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido seleccionado del siguiente grupo, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo: 5

(a) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-532 de la SEC ID Nº 2;

(b) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-417 de la SEC ID Nº 2;

(c) un polipéptido que comprende los aminoácidos 34-432 de la SEC ID Nº 2;

(d) un polipéptido que comprende los aminoácidos 417-531 de la SEC ID Nº 2;

(e) un polipéptido que comprende los aminoácidos 425-531 de la SEC ID Nº 2; 10

(f) un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-531 de la SEC ID Nº 2;

(g) un polipéptido que comprende los aminoácidos 433-493 de la SEC ID Nº 2;

(h) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2 C-terminal al dominio LRR, y un dominio de inmunoglobulina (Ig) de la SEC ID Nº 2 C-terminal a la región básica;

(i) un polipéptido que comprende un dominio de Ig de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio LRR de la SEC ID 15 Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático;

(j) un polipéptido que comprende un dominio LRR de la SEC ID Nº 2, pero que carece de un dominio de Ig de la SEC ID Nº 2, una región básica de la SEC ID Nº 2, y un dominio citoplasmático; y

(k) un polipéptido como en (h), que carece de un dominio citoplasmático;

donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de unirse a NgR1 para aliviar la inhibición 20 mediada por NgR1 de la extensión axonal en una neurona del sistema nervioso central;

(B) dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido que incluye el siguiente motivo de aminoácidos, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

LSPRKH (SEC ID Nº 10);

donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de 25 NgR1; o

(C) dicho polipéptido soluble consiste en el siguiente polipéptido, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

LSPRKH (SEC ID Nº 10);

donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1. 30

2.Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, donde dicho polipéptido soluble consiste en un polipéptido que incluye el siguiente motivo de aminoácidos, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

LSPRKH (SEC ID Nº 10);

donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1. 35

3.Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, donde dicho polipéptido soluble consiste en el siguiente polipéptido, opcionalmente fusionado a un polipéptido heterólogo:

LSPRKH (SEC ID Nº 10);

donde el polipéptido soluble codificado por el ácido nucleico es capaz de bloquear, inhibir o interferir en la función de NgR1. 40

4.Ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, donde el polipéptido de la SEC ID Nº 10 está ciclado.

5.Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en un resto de Ig, un resto de albúmina sérica, un resto de reconocimiento, un resto informador, y un resto que facilita la purificación.

6.Ácido nucleico según la reivindicación 5, donde el resto de Ig es un resto Fc.

7.Vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5

8.Vector según la reivindicación 7, donde dicho ácido nucleico está unido de forma funcional a una secuencia de control de la expresión.

9.Célula hospedadora que comprende el vector según la reivindicación 7 o reivindicación 8.

10.Célula hospedadora según la reivindicación 9, que expresa el polipéptido que está codificado por dicho ácido nucleico. 10

11.Polipéptido aislado codificado por el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho polipéptido es capaz de disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del sistema nervioso central.

12.Polipéptido según la reivindicación 11, donde el polipéptido está conjugado con un polímero.

13.Polipéptido según la reivindicación 12, donde el polímero se selecciona del grupo que consiste en un polialquilenglicol, un polímero de azúcar, y un polipéptido. 15

14.Polipéptido según la reivindicación 13, donde el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG).

15.Polipéptido según la reivindicación 14, donde el polipéptido está conjugado con 1, 2, 3 ó 4 polímeros.

16.Polipéptido según la reivindicación 15, donde el peso molecular total de los polímeros es de 20.000 Da a 40.000 Da.

17.Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la SEC ID Nº 2 o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo o fragmento es capaz de disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una 20 neurona del sistema nervioso central (SNC).

18.Método in vitro para inhibir la transducción de señales por NgR1, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula que expresa NgR1 con una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16.

19.Método in vitro para disminuir la inhibición del crecimiento axonal de una neurona del sistema nervioso central, 25 comprendiendo dicho método poner en contacto dicha neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, o un anticuerpo o segmento del mismo según la reivindicación 17.

20.Método in vitro para inhibir el colapso del cono de crecimiento de una neurona del sistema nervioso central, comprendiendo dicho método poner en contacto la neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, o un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 17. 30

21.Método in vitro para promover la supervivencia de una neurona en riesgo de morir, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha neurona con una cantidad eficaz de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16.

22.Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, o un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 17, en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del 35 sistema nervioso central en un mamífero.

23.Uso de una célula hospedadora según la reivindicación 10 en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central en un mamífero, donde dicha célula hospedadora tiene que introducirse en el mamífero en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o lesión.

24.Uso según la reivindicación 23, donde la célula hospedadora deriva del mamífero a tratar. 40

25.Uso de un vector viral que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido según la reivindicación 11, en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central en un mamífero, donde dicho vector viral tiene que administrarse al mamífero en o cerca del sitio de la enfermedad, trastorno o lesión de modo que dicho polipéptido se exprese a partir de la secuencia nucleotídica en el mamífero en una cantidad suficiente para reducir la inhibición de la extensión axonal por neuronas en o cerca del sitio de la lesión. 45

26.Uso de un vector viral que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido según la reivindicación 11, para la fabricación de un medicamento para promover la supervivencia de una neurona en riesgo de morir en un

mamífero con una enfermedad, trastorno o lesión neurodegenerativa, donde dicho vector viral tiene que administrarse al mamífero en o cerca del sitio de la neurona.

27.Uso según la reivindicación 25 ó 26, donde el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector adenoviral, un vector lentiviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral vaccinia, y un vector viral de herpes simplex. 5

28.Uso según la reivindicación 25 ó 26 donde el vector viral tiene que administrarse por una vía seleccionada del grupo que consiste en administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intratecal, administración subdural y administración subcutánea.

29.Uso según la reivindicación 25, donde la enfermedad, trastorno o lesión del sistema nervioso central es una lesión de la médula espinal o una lesión del nervio óptico. 10

30.Uso según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, donde dicho polipéptido promueve la mielinización.

31.Uso según la reivindicación 26, donde la enfermedad, trastorno o lesión neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, ALS, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, neuropatía diabética, apoplejía, lesión cerebral traumática, y lesión de la médula espinal.

32.Una molécula de ARN interferente que se une específicamente al ácido nucleico según cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 3, donde dicha molécula de ARN interferente es un ARN de horquilla pequeño (shARN) codificado por una molécula de ADN que comprende la SEC ID Nº 41 o la SEC ID Nº 42.