Un método para producir una transglutaminasa microbiana activa a partir de una protransglutaminasa microbiana,

que comprende cultivar un microorganismo en que se ha introducido un gen que codifica una metaloproteasa neutra procedente de actinomicetos, produciéndose por ello la metaloproteasa neutra, y escindir selectivamente una parte proestructural de la protransglutaminasa mediante la metaloproteasa neutra que es producida por el microorganismo, en que la metaloproteasa neutra procedente de actinomicetos se caracteriza por que 1) tiene un peso molecular de aproximadamente 35.000; 2) tiene un pH óptimo de 7,0; 3) es estable en un pH de 4-10; 4) tiene una temperatura óptima de aproximadamente 45 °C; 5) es estable por debajo de aproximadamente 50 °C; y 6) es fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos; o 7) tiene un peso molecular de aproximadamente 71.000; 8) tiene un pH óptimo de 7,0; 9) es estable en un pH de 5-10; 10) tiene una temperatura óptima de aproximadamente 55 °C; y 11) es fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, el ditiotreitol, que es un agente reductor de enlaces disulfuro, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos

Campo del invento

El presente invento se refiere a una nueva proteasa que escinde eficazmente la parte proestructural de una protransglutaminasa para convertir ésta en una transglutaminasa en forma activa, y a un ácido nucleico que la codifica, siendo producida dicha protransglutaminasa por actinomicetos.

El presente invento también se refiere a un método para producir transglutaminasa microbiana en su forma activa usando dicha proteasa. Además, el presente invento se refiere a un método para producir la metaloproteasa neutra. Fundamento del invento

La transglutaminasa es una enzima que cataliza la reacción de transferencia acílica de grupos γ-carboxilamida en la cadena peptídica de la proteína. Cuando se hace reaccionar la enzima con una proteína, puede tener lugar la formación del enlace cruzado ε - (γ - Glu) - Lys y la sustitución de Gln por Glu mediante desamidación. Se han usado transglutaminasas para fabricar productos alimenticios gelificados, tales como gelatinas, yogures y quesos, productos cosméticos gelificados y otros, y para mejorar la calidad de la carne, etc. [publicación japonesa de solicitud examinada (JP-Kokoku) nº 1-50382]. Además, la transglutaminasa es una enzima que tiene una gran utilidad industrial ya que ha sido usada para fabricar materiales para microcápsulas termoestables, soportes para enzimas inmovilizadas, etc.

Se han conocido previamente transglutaminasas de animales, que son dependientes del calcio para expresar sus actividades, y transglutaminasas de microorganismos [transglutaminasa(s) microbiana(s), a la/las que también se hace/hacen referencia más adelante como "MTG(s)" (del inglés, microbial transglutaminase(s)], que son independentes del calcio para expresar sus actividades. En cuanto a la MTG, se ha descubierto una transglutaminasa de una bacteria que pertenece al género Streptoverticillium. Dichas bacterias Streptoverticillium incluyen, por ejemplo, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum subespecie cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium mobaraense (que en adelante puede ser abreviada S. mobaraense) IFO 13819 y otras [publicación de solicitud de patente japonesa no examinada (JP-Kokai) nº 64-27471.

Sin embargo, puesto que estas transglutaminasas han sido producidas por medio de la purificación de cultivos, tales como los de los microorganismos anteriormente descritos, ha habido problemas en cuanto a la cantidad, la eficacia y similares. Entonces, como un método para hacer que se secretaran eficazmente proteínas heterólogas, se estableció el método por el que se seleccionaba una bacteria corineforme como huésped, una proteína fusionada que tenia transglutaminasa conectada cadena abajo con el dominio del péptido señal de una bacteria corineforme, y la transglutaminasa resultaba eficazmente secretada para obtener una gran producción de transglutaminasa (WO 01/23591). En este estudio, se describe un método por el que una MTG es secretada en una forma inactiva como una protransglutaminasa (a la que más adelante se hace referencia como "pro-MTG") en que una parte proestructural está conectada con la MTG, y la parte proestructural de la pro-MTG es luego escindida por una proteasa para convertirla en una transglutaminasa que tiene actividad, así como un método por el que se produce directamente una transglutaminasa activa en el medio de cultivo por coexpresión de SAM-P45, que es una serina proteasa procedente de actinomicetos, en una cantidad necesaria y suficiente en una bacteria corineforme que produce la pro-MTG.

Aunque se supone que un método por el que se produce directamente una transglutaminasa activa por coexpresión de pro-MTG y una proteasa que permite escindir la parte proestructural de la pro-MTG en una bacteria corineforme es un método muy eficaz para producir transglutaminasa, la especificidad de sustrato de SAM-P45 no es tan estricta y puede digerir y degradar no sólo la parte proestructural de la pro-TMG sino también la propia transglutaminasa en cierto grado; por lo tanto, puede que el manejo de SAM-P45 no sea sencillo. Por lo tanto, en los casos en que se utiliza SAM-P45, el método de producción de transglutaminasa debería ser estrictamente controlado para que no tuviera lugar en el medio de cultivo la descomposición de la transglutaminasa producida,

Por lo tanto, queda aún la exigencia de una proteasa que pueda escindir selectivamente sólo la parte proestructural de la pro-MTG y que cause una sobre-descomposición lo más pequeña posible de la propia transglutaminasa, para llevar a cabo ventajosamente la producción de una transglutaminasa en forma activa.

Como una enzima que escinde la parte proestructural de la pro-MTG, además de SAM-P45, se conoce una dispasa procedente de Bacillus polymyxa [Eur. J. Biochem., volumen 257, páginas 570-576 (1998)]. Sin embargo, se requiere una gran cantidad de enzimas para la escisión de la parte proestructural y existe el riesgo de la sobredescomposición de la propia transglutaminasa. Además, una dispasa es un reactivo para cultivo celular, por lo que es costosa como enzima para uso industrial.

Sumario del invento

Como se mencionó anteriormente, queda aún la necesidad de una proteasa que pueda escindir selectivamente sólo la parte proestructural de la pro-MTG y que cause una sobredescomposición lo más pequeña posible de la propia transglutaminasa para llevar a cabo ventajosamente la producción de una transglutaminasa en forma activa. Además, se creyó que, si se pudieran usar proteasas que pudieran escindir selectivamente sólo la parte proestructural de la pro-MTG y que causaran una sobredescomposición lo más pequeña posible de la propia transglutaminasa, esto sería ventajoso para la producción de una transglutaminasa activa. Además, se creyó que, si las proteasas útiles para la producción de transglutaminasa que pueden escindir selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG fueran aquéllas que pueden ser secretadas extracelularmente, esto sería más preferible porque las transglutaminasas activas podrían ser directamente producidas en el medio de cultivo haciendo que se coexpresaran junto con la pro-MTG.

Por lo tanto, un objeto del presente invento es proporcionar una proteasa que sea útil para la producción de transglutaminasa y que escinda selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG.

En particular, un objeto del invento es proporcionar una proteasa que escinda selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG, proteasa que puede ser producida utilizando una bacteria corineforme como huésped, y que pueda ser fácilmente secretada extracelularmente.

Un objeto del invento es también proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifique dicha proteasa.

Otro objeto del invento es proporcionar un método para producir eficazmente MTG utilizando dicha proteasa.

Además, un objeto del invento es proporcionar un método para producir dicha proteasa.

Los inventores del presente invento buscaban una proteasa que escindiera selectivamente la parte proestructural de la pro-MTG pero que causara la menor descomposición posible de la propia transglutaminasa, y más adelante pudieron aislar y purificar una metaloproteasa neutra que tenía dicha propiedad. Los inventores también obtuvieron un DNA que codificaba dicha proteasa, lo introdujeron en una bacteria corineforme, y luego tuvieron éxito en su expresión secretora al utilizar una bacteria corineforme como huésped. Además, la presente enzima fue hecha reaccionar realmente sobre la pro-MTG para escindir la parte proestructural y luego se recuperó la transglutaminasa activa. Los inventores establecieron el presente invento al identificar metaloproteasas neutras procedentes de microorganismos de otras fuentes que tenían una función equivalente, que han demostrado ser similarmente útiles para la producción de una MTG activa.

Es decir, el presente invento es una metaloproteasa neutra de actinomicetos que presenta una elevada selectividad para escindir la parte proestructural de la pro-MTG, y una molécula de ácido nucleico que la codifica.

El presente invento es también un método para producir una MTG activa, que comprende escindir una parte proestructural de una pro-MTG mediante una metaloproteasa neutra.

El presente invento es también un método para producir dicha metaloproteasa, que comprende introducir una molécula de ácido nucleico que codifica dicha metaloproteasa neutra en una bacteria corineforme, cultivar la bacteria corineforme... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una transglutaminasa microbiana activa a partir de una protransglutaminasa microbiana, que comprende cultivar un microorganismo en que se ha introducido un gen que codifica una metaloproteasa neutra procedente de actinomicetos, produciéndose por ello la metaloproteasa neutra, y escindir selectivamente una parte proestructural de la protransglutaminasa mediante la metaloproteasa neutra que es producida por el microorganismo, en que la metaloproteasa neutra procedente de actinomicetos se caracteriza por que

1) tiene un peso molecular de aproximadamente 35.000;

2) tiene un pH óptimo de 7,0;

3) es estable en un pH de 4-10;

4) tiene una temperatura óptima de aproximadamente 45 °C;

5) es estable por debajo de aproximadamente 50 °C; y

6) es fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fenantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos; o

7) tiene un peso molecular de aproximadamente 71.000;

8) tiene un pH óptimo de 7,0;

9) es estable en un pH de 5-10;

10) tiene una temperatura óptima de aproximadamente 55 °C; y

11) es fuertemente inhibida por el ácido etilendiaminotetraacético, la 1,10-fe

nantrolina y el fosforamidón, que son inhibidores de metaloproteasas, el ditiotreitol, que es un agente reductor de enlaces disulfuro, y por el inhibidor de la subtilisina de Streptomyces (SSI) procedente de actinomicetos.

2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el microorganismo en que se ha introducido un gen que codifica una metaloproteasa neutra de actinomicetos es una bacteria corineforme.

3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la metaloproteasa neutra que tiene el peso molecular de aproximadamente 35.000 tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal de la ID. SEC. nº 1.

4. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la metaloproteasa neutra que tiene el peso molecular de aproximadamente 71.000 tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal de la ID. SEC. nº 2.

5. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la metaloproteasa neutra que tiene el peso molecular de aproximadamente 35.000 tiene la secuen

cia de aminoácidos de las posiciones de aminoácido 217-537 de la ID. SEC. nº 6.

6. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que se produce dicha protransglutaminasa al cultivar un microorganismo en que se introducido un gen que codifica la protransglutaminasa.