Procedimiento para el aislamiento de uno o más elementos genéticos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo,

que posee una actividad deseada, que comprende las etapas siguientes: (a) compartimentalización de los elementos genéticos en microcápsulas; (b) expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas; (c) clasificar los elementos genéticos que producen los anticuerpos o fragmentos de los mismos, que poseen la actividad deseada

La presente invención se refiere a la utilización de procedimientos en la evolución in vitro de genotecas moleculares. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para seleccionar ácidos nucleicos que codifican productos génicos en los que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están relacionados mediante compartimentación.

La evolución necesita la generación de diversidad genética (diversidad en los ácidos nucleicos), seguida de la selección de aquéllos ácidos nucleicos que dan lugar a características beneficiosas. A causa de que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado de un organismo están físicamente relacionados (estando confinados los ácidos nucleicos en el interior de las células que codifican), series múltiples de mutación y selección pueden llevar a la supervivencia progresiva de organismos con aptitudes crecientes. Los sistemas para la evolución rápida de los ácidos nucleicos o de las proteínas in vitro deben imitar este proceso a nivel molecular, ya que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado deban estar relacionados y esta actividad del producto génico debe poder seleccionarse.

Avances recientes en biología molecular han permitido que algunas moléculas sean coseleccionadas según sus propiedades junto con los ácidos nucleicos que las codifican. Los ácidos nucleicos seleccionados pueden ser clonados subsiguientemente para un análisis o utilización posterior, o someterse a series adicionales de mutación y selección.

Común a estos procedimientos es el establecimiento de voluminosas genotecas de ácidos nucleicos. Moléculas que poseen las características deseadas (actividad), pueden aislarse a través de regímenes de selección que seleccionan la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una actividad biológica o bioquímica deseada, por ejemplo, la actividad de unión.

La tecnología de presentación de los fagos ha tenido mucho éxito, proporcionando un vehículo que permite la selección de una proteína que se exhibe, proporcionando el enlace esencial entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado (Smith, 1985; Bass et al., 1990); McCafferty et al.,1990; para una revisión, véase Clackson y Wells, 1994). Partículas fágicas filamentosas actúan como conjuntos de exposición genética con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que las codifican en el interior. La estrecha relación entre el ácido nucleico y la actividad del producto codificado es el resultado del ensamblaje del fago en el interior de las bacterias. Como las bacterias individuales se infectan raramente de forma múltiple, en la mayoría de los casos todos los fagos producidos a partir de una bacteria individual, llevarán el mismo elemento genético y exhibirán la misma proteína.

Sin embargo, la presentación de los fagos depende de la creación de genotecas de ácidos nucleicos in vivo en las bacterias. De este modo, la limitación práctica que permite la tecnología de la presentación fágica respecto al tamaño de la genoteca es del orden de 107 a 1011, aventajando incluso a los efectores fágicos  con replicones fágicos filamentosos extirpables. La técnica se ha aplicado principalmente a la selección de moléculas con actividad de unión. También, utilizando esta técnica, se ha aislado un pequeño número de proteínas con actividad catalítica, pero en ningún caso, sin embargo, se llevó a cabo directamente la selección para la actividad catalítica deseada, sino para la unión a un estado de transición análogo (Widersten y Mannervik, 1995), o para la reacción con un inhibidor suicida (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997).

Se han seleccionado ligandos peptídicos específicos para la unión a receptores mediante selección por afinidad, utilizando voluminosas genotecas de péptidos unidos al extremo C del represor lac Lacl (Cull et al., 1992). Cuando se expresa en E. coli, la proteína represora une físicamente el ligando al plásmido codificante mediante la unión a una secuencia del operador lac en el plásmido.

Se ha informado, asimismo, de un sistema enteramente in vitro de presentación polirribosómica (Mattheakis et al., 1994), en el que los péptidos nacientes se unen físicamente mediante el ribosoma al ARN que los codifica.

Sin embargo, el alcance de los sistemas mencionados se limita a la selección de proteínas y no permite posteriormente la selección directa de actividades distintas a la unión, por ejemplo la actividad catalítica o reguladora.

La selección de ARN in vitro y la evolución (Ellington y Szostak, 1990), a la que a veces se ha referencia como SELEX (evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990), permite la selección de actividad tanto de unión como química, pero sólo para los ácidos nucleicos. Cuando la selección es para la unión, un conjunto de ácidos nucleicos se incuba con sustrato inmovilizado. Los que no se unen se descartan, y entonces los que se unen se liberan entonces, se amplifican y el procedimiento se repite en su totalidad en etapas reiterativas para enriquecer las secuencias que mejor se unan. Este procedimiento puede también adaptarse para permitir el aislamiento de ARN catalítico y de ADN (Green y Szostak, 1992; para revisiones, véase Chapman y Szostak, 1994: Joyce, 1994; Gold et al.,1995; Moore, 1995).

Sin embargo, la selección para la actividad "catalítica" o de unión utilizando SELEX es sólo posible porque la misma molécula realiza la función dual de transportar la información genética y ser el catalizador o molécula de unión (aptámero). Cuando la selección es para "auto-catálisis", la misma molécula debe también llevar a cabo la tercera función de ser un sustrato. Ya que el elemento genético debe jugar el papel tanto de sustrato como de catalizador, la selección es sólo posible para los eventos de recambio único. A causa de que el "catalizador" se modifica él mismo en este proceso, no constituye por definición un verdadero catalizador. Además, las proteínas no pueden seleccionarse utilizando el procedimiento SELEX. El abanico de catalizadores, sustratos y reacciones que pueden seleccionarse está, por tanto, severamente limitado.

Aquellos de los procedimientos mencionados que permiten series reiterativas de mutación y selección imitan in vitro mecanismos que se atribuyen habitualmente al proceso de la evolución: variación reiterativa, selección progresiva para una actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de los procedimientos que se han desarrollado hasta ahora han proporcionado moléculas de diversidad y eficacia funcional comparables a las que se encuentran de modo natural. Además, no existen sistemas "evolutivos" propiciados por el hombre que puedan desarrollar tanto ácidos nucleicos como proteínas para llevar a cabo el abanico completo de actividades bioquímicas y biológicas

(por ejemplo, las actividades de unión, catalítica y reguladora) y que puedan combinar

varias procesos que conduzcan a un producto o actividad deseados.

El documento WO 93/03151 describe un procedimiento para el tratamiento de un población heterogénea de células para unir entre sí las copias de dos o más secuencias de ácido nucleico a partir de por lo menos algunas de las células, siendo la disposición de tal manera que las copias de las secuencias de ADN a partir de una célula individual están unidas preferentemente en la proximidad del ácido nucleico del que proceden las copias.

Hans y Plückthun P.N.A.S. 94 (1997) págs. 4.937-4.942 describen un procedimiento de evolución y selección in vivo de las proteínas funcionales utilizando presentación de ribosomas.

El documento DE 46 372 C describe un compuesto que comprende una unidad estructural A (genotipo) y una unidad estructural B (fenotipo) en el que el genotipo y el fenotipo están unidos de manera permanente entre sí.

Existe, por tanto, una gran necesidad de un sistema in vitro que supere las limitaciones que anteriormente se han expuesto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo que posee una actividad deseada, que comprende las etapas siguientes:

(a) compartimentalización de elementos genéticos en microcápsulas;

(b) expresión...

1. Procedimiento para el aislamiento de uno o más elementos genéticos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo, que posee una actividad deseada, que comprende las etapas siguientes:

(a) compartimentalización de los elementos genéticos en microcápsulas;

(b) expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas;

(c) clasificar los elementos genéticos que producen los anticuerpos o fragmentos de los mismos, que poseen la actividad deseada.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que un anticuerpo o fragmento del mismo con la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que permite que la microcápsula que contiene el producto génico y el elementos génico que lo codifica, sean clasificados.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que un anticuerpo o fragmento del mismo que presenta la actividad deseada modifica una o más moléculas en el interior de la microcápsula que permite que la microcápsula que contiene el producto génico y el elemento génico que lo codifica, sean clasificados.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo que posee la actividad deseada induce un cambio en las propiedades ópticas de la microcápsula y de este modo las microcápsulas son clasificadas.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en la etapa (b) la actividad del anticuerpo deseado o fragmento del mismo en el interior de la microcápsula da lugar, directa o indirectamente, a la modificación del elemento genético que codifica el producto génico, para permitir el aislamiento del elemento genético.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo que posee la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que, cuando es detectado, provoca la modificación del elemento genético en el interior del compartimento, para permitir el aislamiento del elemento genético.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el cambio en la microcápsula es un cambio en sus propiedades ópticas.

8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que una parte del elemento genético es un ligando y el anticuerpo deseado o fragmento del mismo en el interior de la microcápsula se une, directa o indirectamente, a dicho ligando para permitir el aislamiento del elemento genético.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende:

expresar los elementos genéticos para producir sus anticuerpos respectivos o fragmentos de los mismos en el interior de las microcápsulas, unir los anticuerpos o fragmentos de los mismos a los elementos genéticos que los codifican y aislar los complejos así formados.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que en la etapa (c) los complejos son clasificados directamente para aislar los elementos genéticos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo que presenta la actividad deseada.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que los complejos son sometidos a una etapa de compartimentalización adicional con el fin de aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta la actividad deseada.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que las microcápsulas son clasificadas según las reivindicaciones 2 a 4.

13. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que los elementos genéticos son clasificados según las reivindicaciones 5 a 10.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos se aíslan a partir de una genoteca de elementos genéticos que codifica un repertorio de anticuerpos o fragmentos de los mismos.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa adicional de:

(d) introducción de una o más mutaciones en el o los elementos genéticos aislados en la etapa (c).

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la repetición reiterativa de una o más de las etapas (a) a (d).

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además la amplificación de los elementos genéticos.

18. Procedimiento para la compartimentalización de un elemento genético que codifica un anticuerpo o fragmento y expresar el elemento genético para formar su anticuerpo o fragmento del mismo en el interior del compartimento, que comprende las etapas que consisten en:

(a) formar una solución acuosa que comprende el elemento genético y los componentes necesarios para expresarlo para formar su producto génico;

(b) microencapsular la solución para formar una microcápsula discreta que comprende el elemento genético; y

(c) exponer la microcápsula a las condiciones apropiadas para proceder a la expresión del elemento genético para formar su anticuerpo o fragmento del mismo.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que una genoteca de elementos genéticos que codifica un repertorio de anticuerpos o fragmentos de los mismos es encapsulada y cada elemento genético expresado para formar su producto génico en el interior de una microcápsula.

20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que la microencapsulación se lleva a cabo formando una emulsión de agua en aceite de la solución acuosa en un medio basado en aceite.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17, en el que los elementos genéticos se clasifican mediante purificación por afinidad.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17, en el que los elementos genéticos son clasificados mediante ablación selectiva de los elementos genéticos que no codifican el anticuerpo deseado o un fragmento del mismo.

23. Procedimiento para la preparación de un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende las etapas que consisten en:

(a) aislar un elemento genético que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1; y

(b) expresar el producto génico que presenta la actividad deseada.