POLIPÉPTIDOS QUIMÉRICOS , HIBRIDOS Y EN TANDEM DE NMB1870 MENINGOCOCICO.

Polipéptidos quiméricos, híbridos y en tándem de NMB1870 meningocócico. Campo de la técnica La presente invención se encuentra en el campo de la inmunización y, en particular, de la inmunización contra enfermedades causadas por bacterias patogénicas del género Neisseria, tales como N. meningitidis (meningococo). Técnica anterior Neisseria meningitidis es una bacteria gramnegativa encapsulada que coloniza el tracto respiratorio alto de aproximadamente 10 % de la población humana. Aunque se dispone de las vacunas de polisacáridos y conjugados contra los serogrupos A, C, W135 e Y, este enfoque no se puede aplicar al serogrupo B porque el polisacárido capsular es un polímero de ácido polisiálico que es un autoantígeno en seres humanos. Para desarrollar una vacuna contra el serogrupo B se han usado proteínas expuestas contenidas en las vesículas de la membrana externa (VMO). Estas vacunas producen respuestas de anticuerpos bactericidas en suero y protegen contra la enfermedad, pero no inducen protección cruzada entre cepas [1]. Por tanto, algunos trabajadores se han centrado en antígenos meningocócicos específicos para uso en vacunas [2]. Uno de estos antígenos es NMB1870. Esta proteína se denominó inicialmente proteína 741 de la cepa MC58 [SEC ID Nº 2535 y 2536 en la ref. 3; SEC ID 1 en el presente documento] y también se ha denominado GNA1870 [refs. 4-6, tras la ref. 2] y ORF2086 [7-9]. Esta lipoproteína se expresa en todos los serogrupos de meningococos y se ha encontrado en múltiples cepas de meningococos. Las secuencias de NMB1870 se han agrupado en tres familias (denominadas en el presente documento familias I, II y III) y se ha encontrado que el suero producido contra una familia dada es bactericida dentro de la misma familia, pero no es activo contra cepas que expresan una de las otras dos familias, es decir existe una protección cruzada dentro de la familia pero no hay una protección cruzada entre familias. Por tanto, para conseguir protección cruzada entre cepas usando NMB1870 se usa más de una familia. Para evitar la necesidad de expresar y purificar proteínas separadas se ha propuesto expresar diferentes familias como proteínas híbridas [10-12], incluidas dos o tres de las familias en una única cadena polipeptídica. Se han analizado varios híbridos y han proporcionara una alentadora eficacia anti-meningocócica. Es un objeto de la invención proporcionar más y mejores enfoques para superar la especificidad de la familia de la protección proporcionada por NMB1870 y para usar estos enfoques para conferir inmunidad contra la enfermedad y/o infección meningocócicas, en particular para el serogrupo B. Divulgación de la invención Como complemento del trabajo descrito en la referencia 13, los inventores han sustituido las secuencias de una familia NMB1870 en la correspondiente posición en otra familia, con la ayuda de producir un NMB 1870 quimérico que no tiene la especificidad de familia de los polipéptidos silvestres. Mientras que cada familia de NMB1870 individual puede producir anticuerpos (p. ej., en ratones) que son eficaces únicamente contra cepas de la misma familia de NMB1870, los polipéptidos quiméricos de la invención pueden producir anticuerpos que reconocen polipéptidos NMB1870 de más de una familia. Sustituciones en la familia NMB1870 La referencia 13 divulga la sustitución de secuencias de una familia de NMB1870 a otro marco de NMB1870, para dar polipéptidos quiméricos de NMB1870. Los inventores han realizado trabajos adicionales con las quimeras y han identificado una serie de residuos clave para la sustitución en la secuencia de NMB1870 de la familia I. La sustitución de estos residuos puede mejorar la capacidad del polipéptido para producir anticuerpos que reaccionen de forma cruzada con los polipéptidos de la familia II. Por tanto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 70 % con la SEC ID Nº 57 y en la que uno o más de los residuos siguientes está sustituido con otro aminoácido: I39; K48; E51; R54; T56; A67; K70; A78; A79; K85; D97; P105; S114; S116; L118; N120; Q121; A122; T147; N149. Se prefiere que al menos uno de los residuos siguientes esté sustituido: I39; T56; K70; A78; A79; K85; D97; S114; S 116; L118. Ninguno de estos residuos se seleccionó para la sustitución en la referencia 13. Los aminoácidos preferidos para la sustitución son: K48; E51; R54; A79; K85; P105; L118; N120; Q121; A122; T147; N149. 2   Preferentemente, los residuos están sustituidos con el correspondiente aminoácido de NMB 1870 en la familia II o la familia III. Por tanto, las sustituciones preferidas son: I39L; K48Q; R54K; T56E; K70R; A78T; A79K; K85R; D97E; P105A; S114L; S116D; L118R; N120G; Q121S; A122E; T147I; N149E; todos estos tienen el mismo aminoácido en dos de las familias I, II y III. La secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 85 % con la SEC ID Nº 57, por ejemplo 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. Esta secuencia puede estar presente como parte de un polipéptido más grande. El polipéptido tiene la capacidad de inducir anticuerpos bactericidas anti-meningocócicos tras la administración a un huésped animal y puede inducir anticuerpos que son bactericidas contra cepas de cada una de las tres familias de NMB1870 I a III. A continuación se proporciona información adicional sobre respuestas bactericidas. Polipéptidos híbridos y en tándem Las referencias 10 a 13 divulgan polipéptidos híbridos en los que una única cadena polipeptídica incluye una secuencia de NMB1870 y una secuencia de polipéptido meningocócico diferente. Por ejemplo, los híbridos que contienen NMB1870 y NadA se divulgan en la referencia 10. La referencia 12 divulga una subpoblación específica de polipéptidos híbridos, denominados polipéptidos en tándem, en los que una cadena polipeptídica sencilla incluye múltiples secuencias de NMB1870, por ejemplo uno de cada familia. En general, un polipéptido híbrido se puede representar con la fórmula: -A-[-X-L-]n-B en la que X es una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de Neisseria, L es una secuencia de aminoácidos ligadora opcional; A es una secuencia de aminoácidos opcional en el extremo N; B es una secuencia de aminoácidos opcional en el extremo C y n es un número entero superior a 1. El valor de n puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más, pero, preferentemente, es 2 o 3. La secuencia -A- está, preferentemente, en el extremo N del polipéptido y la secuencia -B- está, preferentemente, en el extremo C del polipéptido. Al menos uno de los restos X- es una secuencia de NMB1870 de la invención. Para n casos de [-X-L-], la secuencia de aminoácidos ligadora L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n= 2, el híbrido puede ser NH2-X1- L1-X2- L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1- L1-X2-COOH, NH2-X1-X2- L2- COOH, etc. La(s) secuencia(s) de aminoácidos ligadora(s) -L- normalmente serán cortas (p. ej., de 20 o menos aminoácidos, es decir 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Ejemplos incluyen secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, ligadores de poli-glicina (es decir, Glyn, donde n= 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y marcas de histidina (es decir, Hisn, donde n= 3,4,5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos adecuadas en el extremo C serán evidentes para los expertos en la técnica. Un ligador útil es GSGGGG (SEC ID Nº 15), estando el dipéptido Gly-Ser formado a partir de un sitio de restricción BamHI, de modo que ayuda a la clonación y manipulación, y el tetrapéptido Gly4 (SEC ID Nº 16) es otro ligador de poli-glicina típico. Otro ligador útil es la SEC ID Nº 17, que opcionalmente puede estar precedida por un dipéptido Gly-Ser (SEC ID Nº 18, de BamHI) o un dipéptido Gly-Lys (SEC ID Nº 19, de HindIII). -A- es una secuencia de aminoácidos opcional en el extremo N. Esta normalmente será corta (p. ej., de 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (p. ej., marcas de histidina, es decir Hisn, donde n= 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos en el extremo N adecuadas serán evidentes para los expertos en la técnica. Si X 1 carece se su propia metionina en el extremo N, -A- puede proporcionar dicho residuo de metionina en el polipéptido traducido (p. ej., -A- es un solo residuo de Met). La Met puede estar en el extremo N de una secuencia ligadora, tal como la SEC ID Nº 17 (es decir SEC ID 21) o en el extremo N de una secuencia corta (p. ej., la SEC ID Nº 26). Ejemplos de secuencias de -A-... [Seguir leyendo]

1.- Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 85% con la SEC ID Nº 57 y en la que uno o más de los residuos siguientes, En comparación con la SEC ID Nº 57 está sustituido con otro aminoácido. A67; K70; K85; T147; N149; I39; K48; E51; R54; T56; A78; A79; D97; P105; S114; S116; L118; N120; Q121; A122, y en el que el polipéptido tiene la capacidad d einducir anticuerpos que son bactericidas contra cepas de cada una de las tres familias de NMB1870 I a III. 2.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos uno de los residuos siguientes está sustituido; K48; E51; R54; A79; K85; P105; L118; N120; Q121; A122; T147; N149. 3.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos uno de los residuos siguientes está sustituido; I39; T56; K70; A78; A79; K85; D97; S114; S116; L118. 4.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, que comprende una sustitución seleccionada de: K70R; K85R; T147I; N149E; I39L; K48Q; R54K; T56E; A78T; A79K; D97E; P105A; S114L; S116D; L118R; N120G; Q121S; A122E;. 5.- El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 90 % con la SEC ID Nº 57. 6.- Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes. 7. La composición de la reivindicación 6, que incluye un adyuvante. 8. Ácido nucleico que codifica un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 37