MICROMATRICES DE TEJIDO CONGELADO.

La invención se relaciona de manera general con el análisis de tejidos y, más específicamente, con un método y aparato mejorado para formar micromatrices de tejido congelado. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las micromatrices de tejido aumentan el rendimiento de los análisis moleculares al disponer en forma simultánea las proteínas, ácidos nucleídos y otra biomóleculas. Las micromatrices de tejido permiten el estudio de la expresión de proteínas, localización de antígenos y perfilado molecular de las muestras de tejido. Estas micromatrices de tejido incluyen típicamente biopsias cilíndricas de tejido animal o humano tomadas de bloques de tejido embebidos en parafinas ya fijados o de tejidos congelados frescos. Las biopsias cilíndricas se posicionan en un bloque de micromatrices de receptor de tejido que luego se pueden preparar histológicamente para producir secciones para posterior estudio. Las micromatrices de tejido pueden proporcionar un gran número de tejidos que se van a seleccionar sobre un único portaobjetos y permitir una evaluación rápida de tejidos, a gran escala en comparación con las técnicas histológicas convencionales. En la Patente Estadounidense No. 6,103,518 otorgada a Leighton, incorporada aquí como referencia, Leighton describe un instrumento de micromatriz para crear automáticamente micromatrices de tejido. Un ejemplo de esta micromatriz se muestra en la Fig. 1. En la realización ilustrada, se utiliza un punzón /aguja pequeña de receptor para elaborar agujeros en un bloque de receptor 4. Un punzón/aguja más grande de donante 2, que tiene un diámetro interno que corresponde al diámetro externo del punzón de receptor 1, se utiliza para obtener muestras del núcleo de tejido del bloque donante 19. El punzón donante 2 incrusta luego las muestras de núcleo de tejido en los agujeros en el bloque receptor 4 formado por el punzón de receptor 1. Cada punzón 1, 2 está provisto con su propio estilete/émbolo para depurar el material dentro del punzón 1, 2, y cada estilete tiene su propio diámetro que se aproxima al del diámetro interno de su respectivo punzón 1, 2. En su mayor extensión, la punta del estilete se desliza más allá de la punta de punzón 1, 2. Los bloques con la cavidades 24, 25 y los ganchos se utilizan para sostener los punzones respectivos 1, 2 sobre un brazo de pivote 26. El brazo de pivote 26 se monta de manera giratoria sobre un carro vertical o portaobjeto 7 mediante un cojinete de pivote 3. El portaobjeto 7 se mueve verticalmente (eje z) sobre un riel 28, que se mueve de adelante hacia atrás (eje y) sobre un portaobjeto horizontal 8 controlado por un impulsor 10. El portaobjeto horizontal 8 se mueve lateralmente (eje x) sobre otro portaobjeto 9 controlado por otro impulsor 11. El portaobjeto 9 se fija a una placa base 6. Las barras separadoras 13, 14 se fijan a un brazo de pivote 26, y cada barra separadora 13, 14 está provista de un tornillo de ajuste 15. Cada tornillo 15 hace contacto en un lado opuesto del mismo retén 12, que se fija con respecto al portaobjeto 7, limitando por lo tanto el movimiento de pivote y definiendo cuándo el brazo de pivote está en cualquiera de las primera o segunda posiciones. Con el ajuste de los tornillos 5, se puede fijar en forma precisa al extremo exacto de desplazamiento. En un extremo de desplazamiento, el punzón donante 2 se posiciona en registro sobre un agujero especifico en el bloque de receptor, y en el otro extremo del desplazamiento, el punzón receptor 1 está precisamente sobre la misma ubicación, asumiendo que no se han accionado los impulsores 10 y 11 de los ejes x y y . Se fijan imanes 23 a la base 6 y sostienen una placa ferromagnética 22 contra la placa base 6 y contra los bordillos o retenes 21, 27. La placa ferromagnética 22 es parte de un soporte de bloque de receptor 5, que sostiene el bloque receptor 4. El soporte 5, que incluye la placa 22 y contiene el bloque 4, se puede retirar fácilmente de y reinsertar en la misma posición sobre la base 6 en forma alterna, o puede ser mantenido firmemente en el lugar. El bloque 4 se forma a partir de parafina, o de un material similar, y los agujeros de receptores individuales de un patrón de rejilla completo de agujeros de receptor pueden tener núcleos en el bloque de receptor 4 antes de recolectar las muestras del bloque donante 4. El bloque de tejido donante 19 descansa sobre un puente removible 20 que se puede ubicar ente los retenes 21, 27 o a los lados del soporte de bloque de receptor 22. Un problema asociado con la creación de micromatrices de tejido que utilizan el método y aparato descrito anteriormente es la eliminación de material incrustado congelado del bloque de receptor utilizando el punzón de receptor. El punzón se inserta como una aguja en el material incrustado, el material incrustado inmediatamente adyacente a la aguja es calentado por la aguja y se vuelve líquido, y este material de incrustación licuado adyacente a la aguja y de núcleo congelado de material de incrustación reduce la fricción entre la aguja y el núcleo congelado. Durante un intento para eliminar el núcleo congelado de material de incrustación del bloque del receptor al retirar la 2   aguja, si existe fricción insuficiente entre el núcleo congelado de material de incrustación y la aguja, el núcleo congelado se deslizará en relación con la aguja, y el núcleo congelado no se eliminará del bloque del receptor. Otro problema asociado con la creación de micromatrices de tejido es la dificultad en crear núcleos en el bloque de receptor que tengan una profundidad consistente. Para resolver este problema, las micromatrices descritas anteriormente incluyen un juego de retenes de profundidad que permiten tomar muestras de los núcleos de una profundidad exacta desde el bloque donante y el bloque receptor. Este sistema permite que los núcleos procesados en parafina de una profundidad exacta sean colocados en los agujeros que tienen una profundidad idéntica. Debido a que el núcleo procesado en parafina es sólido, el usuario del instrumento puede determinar fácilmente cuándo el núcleo se inserta completamente al detectar la resistencia que resulta del fondo sólido de núcleo que entra en contacto con el fondo del agujero en el bloque de receptor. Sin embargo, los núcleos de tejidos procesados en parafina pueden no ser la mejor opción para demostrar antígenos específicos. Para resolver este problema, se utilizan núcleos de tejidos completamente congelados. Sin embargo, las técnicas utilizadas para controlar el tamaño de los núcleos tienen problemas cuando se utilizan con tejidos completamente congelados puesto que la capacidad de un usuario para detectar cuándo se inserta completamente un núcleo dentro del bloque de receptor está comprometida cuando el núcleo se forma a partir de tejido completamente congelado. Cuando el núcleo se retira del bloque donante, el material inmediatamente adyacente al émbolo se puede congelar ligeramente debido al diferencial de temperatura entre el émbolo y el material congelado. Cuando ocurre el descongelamiento del material congelado, el usuario inserta el núcleo en el bloque de receptor y no detecta exactamente cuándo el fondo del núcleo hace contacto con el fondo del agujero en el bloque de receptor debido a que el material descongelado se flexiona. En razón a que el usuario no puede detectar cuándo se inserta completamente el núcleo, éste no se puede sobreinsertar en el agujero en el bloque de receptor, lo que da como resultado que el núcleo se aplasta. Debido a que el tejido es frágil y se puede dañar al aplastarse, subsiste por lo tanto la necesidad de una metodología y herramienta mejorada para crear micromatrices de tejido congelado que reduzcan esa incidencia de aplastamiento del tejido utilizado para crear las micromatrices. La US2003/038401 A1 se relaciona con un método para la producción de un material de bloque que contiene un número de muestras de prueba, particularmente muestras de tejido, un blanco de material, hecho de parafina y que contiene un número de aberturas para acomodar las muestras de tejidos correspondientes. El bloque de material se produce primero, con lo cual se forma un blanco de material con una disposición regular de aberturas por medio de un molde con la forma adecuada, extendiéndose dichas aberturas desde la primera superficie principal del blanco de material en la dirección de una segunda superficie principal del blanco de material hasta una profundidad específica, que penetra completamente a través del bloque. Estas aberturas se llenan luego con muestras de tejidos en la forma de núcleos de tejidos cilíndricos, y esos núcleos se unen cercanamente con el material circundante del blanco de material por medio de un procedimiento de fusión doble. La US 6103518 A describe un instrumento para construir matrices de tejidos. El instrumento incluye... [Seguir leyendo]

1. Un bloque receptor de tejido (100) para alojar una muestra de tejido en un núcleo (108) que se extiende desde una superficie superior del bloque (100) hasta una superficie interna del bloque (100), comprendiendo el bloque (100): un material de incrustación (102) que se extiende entre la superficie superior del bloque (100) y una superficie inferior del bloque (100) por debajo de la superficie interna del bloque (100); un elemento de liberación (106) dispuesto en la superficie interna del bloque (100), siendo el elemento de liberación (106) un material del que se puede separar el material de incrustación (102), de tal manera que el núcleo (108) se extiende desde la superficie superior del bloque (100) hasta el elemento de liberación (106); y un endurecedor (104) por debajo del elemento de liberación (106) para mantener el elemento de liberación (106) de manera que tenga una superficie sustancialmente plana. 2. El bloque receptor de tejido (100) de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un casete (110) dispuesto por debajo y en contacto con la superficie inferior del material de incrustación (102) para fijar el bloque (100) a un aparato para formar el núcleo (108) y posicionar las muestras de tejido en el núcleo (108). 3. El bloque receptor de tejido (100) de la reivindicación 1, en donde el material de incrustación (102) se selecciona del grupo que consiste en cera de parafina, nitrocelulosa, alcohol polivinílico, carbowax, gelatina y agar. 4. El bloque receptor de tejido (100) de la reivindicación 1, en donde el endurecedor (104) y el elemento de liberación (106) son unitarios. 5. El bloque receptor de tejido (100) de la reivindicación 1, en donde el endurecedor (104) y el elemento de liberación (106) son no unitarios. 6. El bloque receptor de tejido (100) de la reivindicación 4, en donde el elemento de liberación (106) comprende un recubrimiento sobre el endurecedor (104). 7. El bloque receptor de tejido (100) de la reivindicación 1, en donde el elemento de liberación (106) comprende látex. 8. El bloque receptor de tejido (100) de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una pluralidad de núcleos (108) que se extiende desde la superficie superior del bloque (100) hacia el elemento de liberación (106). 9. El bloque receptor de tejido (100) de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente una pluralidad de muestras de tejidos dentro de los núcleos (108), respectivamente, comprendiendo cada una de las muestras de tejidos parafina o tejido congelado completo libre de parafina, y sustancialmente coextensivo con su núcleo respectivo (108). 10. Un método para fabricar un bloque receptor de tejido (100) para alojar una muestra de tejido en un núcleo (108) que se extiende entre una superficie exterior del bloque (100) y una superficie interna del bloque (100), comprendiendo el método: llenar parcialmente un molde (112) con una primera cantidad de un medio de incrustación de líquido, nivelar la superficie expuesta del medio de incrustación para formar una superficie sustancialmente plana sobre el medio de incrustación; congelar la primera cantidad de medio de incrustación; colocar un elemento de liberación (106), del que se pueda separar el medio de incrustación, sobre la superficie sustancialmente plana de la primera cantidad de medio de incrustación; colocar un endurecedor (104), para mantener el elemento de liberación (106) de manera que tenga una superficie sustancialmente plana, sobre el elemento de liberación (106); ubicar un casete (110) dentro del molde (112) para formar una parte inferior del bloque receptor de tejido (100); llenar la parte restante del molde (112) con una segunda cantidad de medio incrustador de líquido, y congelar las primeras y segundas cantidades del medio de incrustación. 11. El método de la reivindicación 10, que comprende llenar parcialmente el molde (112) con la primera cantidad de material incrustado (102) de tal manera que la profundidad a la que se llena el molde (112) es aproximadamente igual a una altura del núcleo (108). 12. El método de la reivindicación 10, que comprende ubicar un nivelador que tiene una superficie plana sobre el medio de incrustación de tal manera que una distancia desde el fondo del molde (112) hasta la superficie plana del nivelador sea aproximadamente igual a una altura del núcleo (108). 13. El método de la reivindicación 12, que comprende apoyar el nivelador sobre un separador para mantener una distancia predeterminada entre la parte inferior del molde (112) hasta la superficie plana del nivelador. 8   14. El método de la reivindicación 10, que comprende recubrir el elemento de liberación (106) con medios incrustadores de líquidos antes de colocar el elemento de liberación (106). 15. El método de la reivindicación 10, que comprende seleccionar el medio de incrustación del grupo que consiste en cera de parafina, nitrocelulosa, alcohol polivinílico, carbowax, gelatina y agar. 16. El método de la reivindicación 10, en donde el elemento de liberación (106) comprende látex. 17. El método de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente: retirar dicho bloque receptor de tejido (100) del molde (112) e invertir el bloque (100) de tal manera que el casete (110) esté en el fondo del bloque (100); insertar un punzón de receptor hueco dentro de la superficie superior del bloque (100) a una profundidad aproximadamente igual a una profundidad en la que se posiciona el elemento de liberación (106); y retirar el punzón de receptor y un núcleo (108) del medio de incrustación del bloque (100) para formar un agujero en el bloque (100) que se extiende desde la superficie superior del bloque (100) hasta el elemento de liberación (106). 18. El método de la reivindicación 17, que comprende adicionalmente: posicionar un núcleo de tejido (108) dentro de una aguja de un punzón de donante hueco sobre el agujero, de tal manera que una superficie inferior de la aguja esté sustancialmente nivelada con la superficie superior del bloque (100); y presionar hacia abajo un émbolo del punzón donante para insertar el núcleo de tejido (108) dentro del agujero del tal manera que el émbolo no se extienda más allá del extremo de la aguja, y el núcleo del tejido (108) se extienda desde la superficie superior del bloque (100) hasta el elemento de liberación (106). 19. Una herramienta para fabricar un bloque receptor de tejido (100) para soportar una muestra de tejido en un núcleo (108) que se extiende desde una superficie superior del bloque (100) hasta una superficie interna el bloque (100), comprendiendo la herramienta: un molde (112) que define una periferia externa y una superficie superior del bloque (100); un nivelador que tiene una superficie plana para posicionarse contra la superficie expuesta de un medio de incrustación líquido llenando parcialmente el molde (112), para formar una superficie sustancialmente plana sobre el medio de incrustación, en donde el nivelador se puede retirar desde el material de incrustación (102) después de que el material de incrustación (102) se ha congelado; y un casete (110) que se ajusta dentro del molde (112) para definir una superficie inferior del bloque (100). 20. La herramienta de la reivindicación 19, en donde el nivelador comprende vidrio. 21. La herramienta de la reivindicación 19, que comprende adicionalmente un separador dentro del molde (112) para mantener una distancia predeterminada entre la parte inferior del molde (112) hasta la superficie plana del nivelador. 9   FIG. 1   11   12   13   14     16   17