PÉPTIDO POLI-EPITOPE DERIVADO DE TIMIDILATO SINTASA QUE TIENE ACTIVIDAD INMUNOLÓGICA Y ANTITUMORAL.

Péptido multiepítope que consiste en la secuencia de aminoácidos del aminoácido 19 al aminoácido 27 de la Seq.

ID Núm. 2 y del aminoácido 1 al aminoácido 9 de la Seq. ID Núm. 2 y del aminoácido 10 al aminoácido 18 de la Seq. ID Núm. 2 para uso médico

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un péptido que tiene actividad antitumoral y a sus composiciones farmacéuticas relacionadas. En particular, la presente invención se refiere a un péptido con actividad antitumoral preventiva y terapéutica, también en conjunto con otros compuestos antitumorales conocidos tales como, por ejemplo, 5-fluorouracilo.

TÉCNICA ANTERIOR

Timidilato sintasa (TS) es una proteína intracelular capaz de regularse por sí misma en respuesta a los niveles de expresión de sus cofactores y sus sustratos. La TS es la fuente principal de timidina en células eucariotas, y es necesaria para la síntesis y duplicación de ADN. Sintetiza timidina añadiendo una unidad de monocarbonato al deoxiuracilo en presencia de folatos reducidos [1,2].

Por lo tanto, la TS está implicada estrictamente en la duplicación del ADN y en la proliferación celular y, por lo tanto, en células normales, su expresión está controlada de forma rigurosa por genes implicados en el ciclo celular, y se expresa de forma temporal solamente durante la fase S [3,4].

Por el contrario, en células tumorales, la TS se expresa de forma constitutiva y su intensidad de expresión es un índice de la proliferación. En base a estas consideraciones, algunos de los fármacos antitumorales más activos, incluyendo los antimetabolitos, actúan directa y/o indirectamente inhibiendo esta enzima [5].

Además, la TS es la diana enzimática crítica inhibida por el monofosfato de 5fluorodeoxiuradina (5-FdUMP), un metabolito de 5-fluorouracilo (5-FU), que es uno de los fármacos citotóxicos más activos y está incluido en casi todos los regímenes de tratamiento de poliquimioterapia utilizados para tratar neoplasmas malignos del aparato gastroentérico, carcinomas de pecho y neoplasmas malignos de cabeza y cuello [6].

El 5-FU es un profármaco de fluoropirimidina que tiene que ser activado en el citoplasma de células neoplásicas en dos metabolitos citotóxicos: trifosfato de 5-fluoro-uridina (5-FUTP) y 5-FdUMP. Este último es en particular responsable de la inhibición permanente de TS con lo que, también en asociación con el folato reducido, forma un complejo terciario estable que es degradado rápidamente en el citoplasma celular por el sistema de proteosomas responsables de la formación de epítopes de péptido derivados de antígenos de tumor.

Muchos estudios en la actualidad han demostrado que la sobreexpresión constitutiva o adquirida de TS, así como sus mutaciones, son mecanismos de escape válidos para las células tumorales porque les confieren resistencia a 5-FU [7].

En este sentido, numerosos estudios en la actualidad han demostrado que la detección de altos niveles de TS o de sus mutaciones en pacientes con carcinomas gástricos o de colon es predictiva de resistencia al fármaco y se consideran factores de pronóstico negativo [8,9].

Incluso en las células tumorales que expresan de forma constitutiva niveles bajos o intermedios de TS, la enzima está, en todo caso, sometida a actividad autorreguladora potente porque, después de la exposición a 5-FU solamente durante cinco horas, estas células también muestran una respuesta adaptativa, con una sobreexpresión clara e inmediata de la enzima [10].

Por lo tanto, es evidente que existe una necesidad de desarrollar una herramienta terapéutica que pueda superar la incapacidad de 5-FU, sola o conjuntamente con distintos agentes quimioterapéuticos, de suprimir totalmente la enfermedad neoplásica y de curar así a pacientes con neoplasmas malignos, particularmente de pecho y del aparato gastroentérico.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado un agente peptídico antitumoral con actividad inmunoterapéutica, designado TS/PP, que también se puede combinar con quimioterapia convencional basada en fluoropirimidina y es capaz de obtener, in vivo e in vitro, una respuesta de linfocitos T citotóxica poliepítope, capaz de destruir las células tumorales que sobreexpresan la enzima TS. Como la expresión de la proteína TS es una de las primeras alteraciones que ocurren en todos los tumores humanos durante la carcinogénesis, el péptido de la presente invención tiene también una acción immunoprotectora preventiva además de su actividad terapéutica.

TS/PP es un péptido sintético de 28 aminoácidos caracterizado por el hecho de que contiene varias secuencias de aminoácidos de un epítope natural, algunas de las cuales son potencialmente capaces de unirse a diferentes haplotipos de moléculas de HLA de clase I (que incluyen los tres epítopes conocidos específicos para las moléculas HLA-A(*)02.01: TS-1, TS-2 y TS-3) [11], y para las moléculas de HLA de clase II. La actividad inmunológica y antitumoral de TS/PP se ha demostrado en modelos humanos in vitro y en ratones (ratones transgénicos HHD) genéticamente manipulados con moléculas humanas de la clase I del sistema principal de histocompatibilidad (haplotipo HLA-A(*)02.01) que expresan una TS que es muy similar a la TS humana (similitud de aminoácidos del 90-95%).

En el modelo humano, TS/PP ha sido utilizado para generar líneas de linfocitos T citotóxicas (CTL) in vitro estimulando de forma cíclica células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) (derivadas de donadores normales y de donadores con neoplasmas malignos) con dosis bajas de interleuquina 2, y en cultivos en conjunto con células dendríticas autólogas expuestas previamente a TS/PP. Estas líneas linfocíticas manifiestan actividad citotóxica significativa contra células tumorales de carcinoma de pecho y de colon (HLA-A(*)02.01+). Esta actividad citotóxica aumenta de forma dramática si las células tumorales son expuestas con anterioridad a dosis subletales de 5-FU capaces de aumentar la expresión endógena de TS.

En el modelo animal, TS/PP administrado a ratones de HHD inoculados con células leucémicas (EL-4 HHD) autólogas que expresan TS, tiene potente actividad antitumoral (preventiva y terapéutica) que es incrementada por el tratamiento combinado con 5-FU. La actividad antitumoral e inmunogénica de TS/PP no está asociada con el comienzo de ningún evento adverso o autoinmunidad sino que, en los modelos murino y humano, es mucho mayor que la ejercida por los péptidos de epítope conocidos de TS (TS-1, TS-2 y TS-3) utilizados individualmente o en combinación.

La presente invención también se refiere a un método para generar in vitro líneas de CTL específicas de TS (y multiepítopes) con actividad antitumoral para ser utilizadas en la inmunoterapia de pacientes neoplásicos. Las líneas linfocíticas a ser reinfundidas en los pacientes neoplásicos son de hecho generadas por medio de la estimulación cíclica ex vivo de las células mononucleares de sangre periférica de los pacientes (PBMC).

(HLA-(*)02.01+, recogido por medio de leucoféresis) con dosis bajas de IL-2 y células dendríticas autólogas expuestas al péptido TS/PP.

La presente invención también se refiere a la capacidad del péptido TS/PP de evitar el inicio de la formación de tumores en ratones transgénicos positivos a HLA-(*)02.01 (HHD) e inoculados con células tumorales autólogas (EL-4/HHD).

La presente invención también se refiere a la capacidad del péptido TS/PP de inducir una respuesta inmune con actividad antitumoral en ratones transgénicos positivos a HLA-(*)02.01 (HHD) e inoculados con células tumorales autólogas (EL-4/HHD) en ausencia de una respuesta autoinmune y/o tóxica.

Además, la presente invención se refiere a la terapia antitumoral combinada de TS/PP y 5-FU como tratamiento quimioinmunoterapéutico de carcinomas sensibles a fluoropirimidina (carcinomas gastroentéricos, de pecho y de cabeza y cuello).

El objeto de la presente invención es por lo tanto un péptido multiepítope que consiste en la secuencia de aminoácidos del aminoácido 19 al aminoácido 27 de la Seq. ID Núm. 2 y del aminoácido 1 al aminoácido 9 de la Seq. ID Núm. 2 y del aminoácido 10 al aminoácido 18 de la Seq. ID Núm. 2 para uso médico.

En una forma alternativa preferente, el péptido consiste en la secuencia YMIAHITGLFLDSLGFSTTLGDAHIYL (Seq. ID Núm. 2).

Un objeto adicional de la presente invención es un péptido que tiene la secuencia YMIAHITGLFLDSLGFSTTLGDAHIYL (Seq. ID Núm. 2).

Un objeto adicional de la presente invención es un vector que comprende, y es... [Seguir leyendo]

1. Péptido multiepítope que consiste en la secuencia de aminoácidos del aminoácido 19 al aminoácido 27 de la Seq. ID Núm. 2 y del aminoácido 1 al aminoácido 9 de la Seq. ID Núm. 2 y del aminoácido 10 al aminoácido 18 de la Seq. ID Núm. 2 para uso médico.

2. Péptido, según la reivindicación 1 que consiste en la secuencia YMIAHITGLFLDSLGFSTTLGDAHIYL (Seq. ID Núm. 2).

3. Péptido que tiene la secuencia YMIAHITGLFLDSLGFSTTLGDAHIYL (Seq. ID Núm. 2).

4. Vector que comprende, y es capaz de expresar de forma eficaz en una célula eucariota, una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Vector, según la reivindicación 4, cuya secuencia de nucleótidos es TACATGATTGCGCACATCACGGGCCTGTTTTTGGACAGCCTGGGATTCTCCACC ACTTTGGGAGATGCACATATTTACCTG (Seq. ID Núm: 1)

6. Composición farmacéutica con actividad antitumoral preventiva que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del péptido según las reivindicaciones 1 a 3, y excipientes adecuados y/o diluyentes y/o agentes solubilizantes.

7. Composición farmacéutica con actividad quimioterapéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del péptido según las reivindicaciones 1 a 3, y excipientes adecuados y/o diluyentes y/o agentes solubilizantes.

8. Composición farmacéutica, según la reivindicación 6 ó 7, que comprende un fármaco activo antitumoral adicional.

9. Composición farmacéutica, según la reivindicación 8, en la que dicho ingrediente activo antitumoral adicional es 5-fluoracilo.

10. Método para obtener linfocitos T citotóxicos in vitro (CTL) activados para TS, que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar in vitro células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de un individuo y;

b) estimular in vitro dichas PBMC exponiéndolas a células dendríticas autólogas irradiadas expuestas previamente durante un tiempo oportuno a concentraciones eficaces del péptido según reivindicaciones 1 a 3.

11. Linfocitos T citotóxicos activados para TS obtenibles mediante el método según la reivindicación 10.

12. Linfocitos T citotóxicos activados para TS, según la reivindicación 11, para uso en inmunoterapia.