Secuencias peptídicas, su forma ramificada y uso de estas para aplicaciones antimicrobianas.

Un péptido antibacteriano que tiene del terminal amino al carboxílico una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de:

KKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 1, RRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 2, KRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 3, RKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 4.

Secuencias peptídicas, su forma ramificada y uso de estas para aplicaciones antimicrobianas Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a la identificación de potentes secuencias peptídicas antimicrobianas que son particularmente resistentes a la actividad de las proteasas y, por consiguiente, muy adecuadas para uso in vivo, particularmente cuando son sintetizadas en la forma MAP tetra-ramificados. Las secuencias de la presente invención (KKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 1, RRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 2, KRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 3, RKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 4) se derivaron del péptido M6 reportado anteriormente que porta una Gln como primer residuo amino-terminal. La eliminación de la Gln dio una mejora imprevista y sorprendente en la estabilidad del péptido y en la homogeneidad de un lote a otro, y, en consecuencia, permitió un método fiable para la síntesis de péptidos que es particularmente difícil para el péptido M6.

Antecedentes de la técnica

La creciente emergencia de bacterias resistentes a múltiples medicamentos es una preocupación mundial, sobre todo en aquellos países donde los antibióticos se usan ampliamente en las clínicas. Un número de patógenos como Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, algunos enterococos, Pseudomonas aeruginosa y muchas otras bacterias Gram-negativas han desarrollado resistencia contra los antibióticos tradicionales así como también contra aquellos de nueva generación (Wenzel y Edmond 2). Por lo tanto, desarrollar nuevos antibióticos se ha vuelto cada vez más importante. Esta demanda insta a la comunidad de investigadores y a las compañías farmacéuticas a considerar nuevos agentes antimicrobianos. Los péptidos antimicrobianos son considerados una de las mejores alternativas a los antibióticos tradicionales que generalmente causan la selección de bacterias resistentes (Hancock y Sahl 26). La mayoría de los péptidos antibacterianos son componentes de la inmunidad innata de los animales, que incluye los seres humanos, plantas y hongos (Zasloff, 22). Ellos suelen consistir en 6-5 residuos de aminoácidos y tienen una carga neta positiva. Los péptidos catiónicos interactúan selectivamente con las membranas bacterianas aniónicas y con otras estructuras cargadas negativamente tales como LPS y el DNA. Las membranas eucariotas, en su capa externa, están normalmente menos cargadas negativamente que la de las bacterias, y, a diferencia de la membrana bacteriana, además se estabilizan por moléculas de colesterol. Estas diferencias son la base de la especificidad de los péptidos catiónicos. El mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos catiónicos es, en consecuencia, debido a su unión específica a las membranas bacterianas, lo que provoca la permeación celular y, en algunos casos, la inhibición de las vías metabólicas.

Muchos estudios entonces, se destinan a la identificación y caracterización de secuencias peptídicas antimicrobianas mediante el estudio de su mecanismo de acción, su toxicidad para las células eucariotas y su eficacia terapéutica cuando se administran tópica o sistémicamente. Desafortunadamente, hasta ahora, dos problemas principales obstaculizaron el desarrollo de fármacos de péptidos antimicrobianos. El primero es que la selectividad de los péptidos antimicrobianos naturales para las bacterias es generalmente demasiado baja y que parecen ser muy tóxicos para las células eucariotas, particularmente eritrocitos, lo que genera un alto nivel de hemolisis. El segundo está relacionado con la vida media generalmente corta de los péptidos in vivo. Estas son las principales razones por las que sólo unos pocos péptidos catiónicos llegaron al mercado en los últimos 1 años (la polimixina y la daptomicina son dos ejemplos de éxito).

Hace unos años, los investigadores comenzaron a concentrarse en la identificación de nuevas secuencias peptídicas de origen no natural, seleccionadas en el laboratorio mediante el diseño racional o la selección de bibliotecas combinatorias. El objetivo fue encontrar péptidos con mejores propiedades biológicas en términos de toxicidad general y especificidad para las bacterias y la mejoría de la vida media para el desarrollo de fármacos.

En el laboratorio de los inventores, se identificó una secuencia de péptido no natural, que mostró una fuerte actividad antimicrobiana, especialmente contra las bacterias Gram-negativas (Pini y otros, 25 WO 26/6195). El péptido, (QKKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 5, nombrado M6) se obtuvo mediante modificaciones racionales de una secuencia identificada a partir de una biblioteca combinatoria, fue sintetizado en la forma tetra-ramificada MAP donde cuatro secuencias peptídicas idénticas están unidas entre sí por un núcleo de lisina. Esta molécula mostró una alta resistencia a las proteasas y peptidasas, por tanto, supera el problema de la vida media corta (Bracci y otros, 23; Falciani y otros, 27). El péptido antimicrobiano ramificado M6 ya se caracterizó por su actividad biológica contra una serie de bacterias, que incluye varios aislados clínicos resistentes a múltiples drogas, por sus interacciones con el DNA, por su toxicidad in vitro contra varias líneas de células eucariotas, así como por su actividad hemolítica, por su inmunogenicidad, por su toxicidad in vivo cuando se inyecta intraperitonealmente o intravenosamente (Pini y otros, 27).

Durante todos los experimentos llevados a cabo para la caracterización de M6 notamos que diferentes síntesis de M6

produjeron péptidos con actividades no homogéneas (disimilitud de lote a lote) (Figura 1A). El análisis de espectrometría de masas reveló que el primer aminoácido de M6, a saber, Gln, se convierte en ácido piroglutámico (Figura 1B). La presencia de los diferentes péptidos que contienen ácido piroglutámico y no Gln cambia de un lote a otro en un porcentaje impredecible. La completa eliminación de este producto secundario es en los hechos imposible, en primer lugar, porque no se descarta fácilmente durante la purificación por FIPLC debido al tiempo de retención similar al del producto principal, y en segundo lugar porque cuando está en disolución se produce continuamente a partir del péptido parental. Dado que el análogo piroGlu mostró una actividad antimicrobiana sensiblemente reducida con respecto al análogo de Gln, la actividad global de la mezcla varió de un lote a otro (Figuras 1 A).

Con el objetivo de minimizar la disimilitud de un lote a otro, en la perspectiva de una producción del péptido a gran escala para experimentos preclínicos y, posiblemente, para la fabricación industrial, hemos eliminado del M6 el primer residuo de Gln y además reemplazamos las dos primeras Lis con Arg o alternamos los dos primeros residuos con Lis y Arg.Esto produjo las siguientes secuencias 9-mer privadas de la primera Gln presente en la secuencia M6: KKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 1, nombrada M33; RRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 2, nombrada M34; KRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 3, nombrada M35; RKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 4, nombrada M36. Estas secuencias son el objetivo de la presente solicitud.

Los nuevos péptidos se sometieron a varias caracterizaciones descritas en los ejemplos siguientes.

Prácticamente, la eliminación de un único residuo de aminoácido en el extremo del N terminal de la secuencia del péptido M6, y la posible alternancia de Lis y Arg en las dos primeras posiciones, produce una mejor actividad antimicrobiana, y no causa ningún comportamiento diferente en términos de toxicidad secundaria y mecanismo de acción. De hecho, se produce una fuerte mejora en la responsabilidad de la síntesis, haciendo que las secuencias de péptidos M33, M34, M35 y M36 sean mucho más adecuadas para un desarrollo industrial con respecto al M6. Gracias a la mejora en la estabilidad y en la homogeneidad de un lote a otro, las secuencias M33, M34, M35 y M36 son candidatos ideales para el desarrollo de fármacos antimicrobianos.

Descripción de la invención

Es un objetivo de la presente invención las secuencias peptídicas KKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 1, M33, RRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 2, M34, KRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 3, M35, RKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 4, M36, sintetizadas en estructura monomérica o dendrimérica, preferentemente en forma de Péptido de Múltiples Antígenos (MAP) que sigue la fórmula general:

donde R es un péptido monomérico con una secuencia escogida del grupo de M33, M34, M35 y M36 (todos los R son la misma secuencia en una molécula MAP), X es una molécula trifuncional y Z es una molécula trifuncional como X o el siguiente grupo químico:

R

R

X

donde R y X se definen anteriormente.

1. Un péptido antibacteriano que tiene del terminal amino al carboxílico una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: KKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 1, RRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 2, KRIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 3, RKIRVRLSA, sec. con núm. de ident. 4.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 que es de forma lineal.

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 2, multimerizado en un esqueleto de poliacrilamina, en un esqueleto de unidades de dextrano o un esqueleto de unidades de etilenglicol.

4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que está en forma de Péptidos de Múltiples Antígenos (MAP), con la siguiente fórmula:

en la cual R es el péptido como se reivindica en la reivindicación 1; X es una molécula trifuncional; m = o 1; n = o 1; cuando m y n son el péptido es un dímero; cuando m=1 y n= el péptido es un tetrámero, cuando m=1 y n=1 el péptido es un octámero.

5. El péptido MAP de acuerdo con la reivindicación 4, en donde X es una unidad trifuncional.

6. El péptido MAP de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la unidad trifuncional comprende al menos dos grupos amino funcionales.

7. El péptido MAP de acuerdo con la reivindicación 6, en donde X es lisina, ornitina, norlisina o amino alanina.

8. El péptido MAP de acuerdo con la reivindicación 4, en donde X es ácido aspártico o ácido glutámico.

9. El péptido MAP de acuerdo con la reivindicación 4, en donde Xeis propilenglicol, ácido succínico, derivado de diisocianatos o diaminas.

1. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso médico.

11. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes como un fármaco antibacteriano.

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable y eficaz del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 u 11.

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en forma de una solución para inyectar en individuos para uso sistémico.

15.

16.

17.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en forma de una solución para inyectar como agente desintoxicante para la neutralización de LPS.

La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en forma de un lavado para los ojos, enjuague bucal, pomada o solución para uso tópico.

Una preparación desinfectante y/o detergente con actividad antibacteriana que comprende el péptido de acuerdo con la reivindicación 1 a 11.

Uso del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 a 11 como un conservante para la preparación de productos alimenticios y/o de productos cosméticos y/o de productos homeopáticos.