Péptidos multiméricos ramificados para diagnóstico y terapia de tumores.
Un péptido multimérico que tiene las fórmulas generales A o B:
**Fórmula**
o**Fórmula**
en las que
n ≥ 1 a 5,
X ≥**Fórmula**
en la que m ≥ 1 a 27,
o**Fórmula**
en la que p ≥ 1 a 5,**Fórmula**
en la que m ≥ 1-27 y q ≥ 1 a 5,
o,**Fórmula**
en la que q ≥ 1 a 5,
o**Fórmula**
en la que q ≥ 1 a 5
W ≥**Fórmula**
o**Fórmula**
o**Fórmula**
o**Fórmula**
o**Fórmula**
y Z ≥ NH2 u OH, en las que cada péptido tiene una secuencia derivada de Neurotensina (NT), para su uso como agente antitumoral.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/001224.
Solicitante: UNIVERSITA DEGLI STUDI DI SIENA.
Nacionalidad solicitante: Italia.
Dirección: 55, VIA BANCHI DI SOTTO I-53100 SIENA ITALIA.
Inventor/es: PINI,ALESSANDRO, FALCIANI,CHIARA, BRACCI,LUISA, FABBRINI,MONICA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K38/09 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Hormona que libera a la hormona luteinizante [LHRH]; Péptidos relacionados.
- A61K38/10 A61K 38/00 […] › Péptidos que tienen de 12 a 20 aminoácidos.
- A61P35/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › Agentes antineoplásicos.
- C07K7/08 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 7/00 Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › con 12 a 20 aminoácidos.
- C07K7/23 C07K 7/00 […] › Hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH); Péptidos semejantes.
- G01N33/68 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.
PDF original: ES-2544954_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Péptidos multiméricos ramificados para diagnóstico y terapia de tumores
La presente invención se refiere a péptidos ramificados estables in vivo, en particular derivados de la secuencia de Neurotensina (NT), conjugados con unidades funcionales para abordar específicamente células cancerosas, para diagnóstico o terapia de tumores que expresan NT.
Técnica antecedente
Uno de los problemas principales en quimioterapia clásica es la toxicidad no específica de la mayoría de los agentes anticancerosos contra células normales. El abordaje específico de tumores ha sido el desafío principal en las investigaciones en terapia y diagnóstico de cánceres.
Actualmente, las terapias innovadoras específicas de tumor siguen la estrategia de abordar proteínas asociadas a tumor, específicamente expresadas o sobreexpresadas en células tumorales.
La observación de que receptores para diferentes péptidos reguladores endógenos se expresan en varios cánceres humanos primarios, abrió nuevas perspectivas sobre el uso de péptidos sintéticos para abordaje selectivo de tumores.
La Neurotensina (NT) es un péptido de 13 aminoácidos (QLYENKPRRPYIL) originalmente aislado de hipotálamo de terneras, -[-¡ene ¡a doble función de neurotransmisoro neuromodulador en el sistema nervioso y hormona local en la periferia. Los receptores de NT se sobreexpresan en varias neoplasias como cáncer pulmonar microcítico, carcinomas de colon, pancreático y de próstata. Se han propuesto análogos estabilizados por NT para terapia tumoral desde hace varios años^° y la NT aún se considera el mejor candidato posible para terapia basada en péptidos de carcinomas pancreáticos exocrinos^ en consideración de la alta incidencia y densidad de receptores de NT en estos tumores. Más del 75 % de todos los carcinomas pancreáticos ductales sobreexpresan receptores de NT, mientras que el tejido normal del páncreas, el páncreas con pancreatitis y el páncreas endocrino no^.
La presencia de receptores específicos sobre membranas de diversas células tumorales hace que los análogos de NT sean excelentes elecciones como moléculas de vehículo. El abordaje de receptores tumorales es fundamental para enfocar el problema de toxicidad no específica de quimioterapias contra el cáncer y es una herramienta valiosa para localización de tumores por radioisótopos. No obstante, el uso de péptidos ;n v/vo ha estado muy limitado por su corta semivida.
Los inventores demostraron previamente que la síntesis de péptidos en forma multimérica ramificada produce moléculas que pueden retener actividad biológica peptídica y son muy resistentes a la actividad proteolítica de los fluidos biológicos, teniendo por tanto una semivida marcadamente mayor respecto a los péptidos monoméricos correspondientes^.
La presente invención se refiere a péptidos multiméricos estables in vivo derivados de NT conjugados a unidades funcionales para el abordaje específico de células cancerosas, para diagnóstico o terapia de tumores que expresan
NT.
Descripción de ia invención
Un objeto de la presente invención es un péptido multimérico que tiene la fórmula general A o B.
Péptido - NH Péptido rNi-
**(Ver fórmula)**0
**(Ver fórmula)**0
Péptido - NH
A
Péptido}- NH
O
**(Ver fórmula)**en la que n = 1 a 5, X =
en la que m = 1 a 27, o
en la que p = 1 a 5,
**(Ver fórmula)**O
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**en b que m = 1-27 y q = 1 a 5, o
**(Ver fórmula)**en la que q = 1 a 5, o
**(Ver fórmula)**en la que q = 1 a 5 W =
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**yZ = NH2U OH,
en las que cada péptido tiene esencialmente una secuencia derivada de Neurotensina (NT), para su uso como agente antitumoral.
Preferiblemente, el péptido multimérico es para uso como agente antitumoral, en el que cada péptido que tiene una secuencia derivada de Neurotensina (NT) tiene esencialmente la siguiente secuencia de aminoácidos: QLYENKPRRPYIL o RRPYIL. En una realización preferida, el péptido multimérico para su uso como agente antitumoral está conjugado con una unidad funcional.
Un objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el péptido multimérico, o una sal farmacéuticamente aceptable y eficaz del mismo y diluyentes, y/o disolventes y/o vehículos y/o excipientes.
Un objetivo de la presente invención es el uso del péptido multimérico para diagnóstico de tumores, preferiblemente para tumores que expresan neurotensina.
Un objetivo de ia presente invención es un método para diagnosticar in vitro un tumor en una muestra que comprende ias etapas de:
a) incubar ia muestra con ei péptido muitimérico en condiciones apropiadas para permitir ia unión específica dei péptido a ia muestra, y
b) detectar e) péptido unido.
Preferiblemente el tumor expresa receptores de neurotensina, más preferiblemente el tumor es un carcinoma pulmonar microcítico, de colon, pancreático, de próstata, de endometrio u ovario, o un cáncer de mama.
La invención se describirá ahora por ejemplos no limitantes que se refieren a las siguientes figuras:
Figura 1. Estructura de 1: NT(8-13)4 tetramérico-PEG-Biotina (NT4(8-13)-Bio) y 2: NT(8-13)4 tetramérico-PEG- Tetrametil rodamina (NT4(8-13)-TMR).
Figura 2. Síntesis de 3: NT(8-13)4 tetrarramificado-PEG-Cloro e6 (NT4(8-13)-Che6) y 4: NT(8- 13)tetrarramificado-PEG-Metotrexato (NT4(8-13)-MTX).
Figura 3. Unión e intemalización en la célula del péptido NT4(8-13). Imágenes de microscopia confocal de células HT29 incubadas con NT4(8-13)-TMR (5 pg/ml en PBS-BSA al 1 %) durante 1 h a 4*0 para permitir la unión del péptido, lavadas y después incubadas a 37*0 con medio previamente calentado durante 0 h (panel A, NT4(8-13)-TMR está sobre la superficie de la membrana, véase la flecha), 2 h (panel B, NT4(8-13)-TMR está sobre la superficie de la membrana o dentro de la célula, véanse las flechas), 4h (panel C, NT4(8-13)-TMR está solamente dentro de la célula, véase la flecha) y 18 horas (panel D, sin señal de NT4(8-13)-TMR). Después de fijar con formalina al 4 %, la membrana plasmática se tiñó de verde con concanavalina A-biotina y avidina-FITC. Se realizaron experimentos similares incubando células HT29 con NT4(8-13) mezclado-TMR (panel E, sin señal de rodamina) y células HaCat con NT4(8-13)-TMR (panel F, sin señal de rodamina) durante 1h a 4"C.
Figura 4. Localización lisosómica de NT4(8-13)-TMR. Se incubaron células HT29 con NT4(8-13)-TMR en condiciones de intemalización (incubación de 1 h a 4*0 con NT4(8-13)-TMR seguida por incubación durante 4 en DMEM a 37"C) y después se trataron con lysotracker verde para teñir los lisosomas. El panel A muestra el lysotracker verde, el panel B muestra la señal roja del péptido y el panel C muestra su colocalización que da una señal amarilla (véanse las flechas).
Figura 5. Unión de NT4(8-13) a biopsias tumorales de colon y páncreas. Imágenes de microscopía confocal de (A) secciones de carcinoma de colon humano, (B) colon sano, (C) carcinoma pancreático y (D) páncreas sano. Después de fijar con paraformaldehído al 4 % y saturación con FCS, las secciones se incubaron con NT4(8-13)- blotlna (0,5 pg/ml en PBS-BSA al 3 %) durante 30' a 37"C, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con avidina-FITC (0,5 pg/ml en PBS-BSA al 3 %) durante 30' a temperatura ambiente.
Figura 7. Regeneración de NTR. (A) Primero se incubaron células HT29 con NT4(8-13)-TMR (100 pg/ml) durante 1 h a 4°C y después, tras lavar, con NT4(8-13)-Bio seguido por avidina-FITC, solamente es visible tinción roja de NT4(8-13)-TMR. (B) Se incubaron células HT29 con NT4(8-13)-TMR como en (A), lavadas, mantenidas durante 18 h a 37°C en medio de cultivo y tratadas con NT4(8-13)-Bio y avidina-FITC. La punta de la flecha indica la localización en rojo de NT4(8-13)-TMR, la flecha completa indica la señal verde de NT4(8-13)-Bio-av¡dina FITC. Figura 8. Cltotoxlcldad de NT4(8-13)-Che6. Se sembraron células HT29 en una microplaca de 96 pocilios y se Incubaron a 37°C en la oscuridad durante 4 horas con diferentes concentraciones de NT4(8-13)-Che6 (*), NT4(8- 13) mezclado-Che6 (A) y Che6 libre (n). Las células después se lavaron para eliminar el conjugado no unido y se Irradiaron (excepto para controles de oscuridad) con una dosis total de luz 3 J/cm^. Se evaluó la fototoxicidad del fármaco midiendo la supervivencia celular, usando el ensayo de MTT 24 horas después de la irradiación. Los controles negativos (-) Incluyeron células HT29 incubadas con el conjugado y no irradiadas, células irradiadas y no Incubadas... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un péptido multimérico que tiene las fórmulas generales A o B:
o
en las que = 1 a 5,
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**en la que m = 1 a 27, o
**(Ver fórmula)**en la que p = 1 a 5,
**(Ver fórmula)**en la que m = 1 -27 y q = 1 a 5, o
**(Ver fórmula)**en la que q = 1 a 5, o
en la que q = 1 a 5 W =
o
o
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**fí
o
**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**yZ = NH2U OH,
en las que cada péptído tiene una secuencia derivada de Neurotenslna (NT), para su uso como agente antltumoral.
2. El péptído multlmérlco de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como agente antltumoral, en donde cada péptldo que tiene una secuencia derivada de Neurotensina (NT) tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
QLYENKPRRPYILo RRPYIL.
3. El péptido multimérico de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 para su uso como agente antitumoral que está conjugado con una unidad funcional.
4. Composición farmacéutica que comprende el péptido multimérico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente aceptable y eficaz del mismo y diluyentes, y/o disolventes y/o vehículos y/o excipientes.
5. Uso del péptido multimérico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 para diagnóstico de tumores.
6. Método para diagnosticar in vitro un tumor en una muestra, que comprende las etapas de:
a) incubar la muestra con el péptido multimérico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones apropiadas para permitir la unión específica del péptido a la muestra, y 15 b) detectar el péptido unido.
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