Una molécula de enlace que es capaz de unirse a la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:

1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, con una constante de disociación <1000nM, y que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia las siguientes CDRs: cualquiera de las dos, (i) CDR-H1 de SEQ ID NO:12, CDR-H2 de SEQ ID NO:13, CDR-H3 de SEQ ID NO:14, CDR-L1 de SEQ ID NO: 15, CDR-L2 de SEQ ID NO:16 y CDR-L3 de SEQ ID NO:17, o, (ii) CDR'-H1 de SEQ ID NO:18, CDR'-H2 de SEQ ID NO:19, CDR'-H3 de SEQ ID NO:20, CDR'-L1 de SEQ ID NO:21, CDR'-L2 de SEQ ID NO:22 y CDR'-L3 de SEQ ID NO:23

La presente invención se relaciona con las moléculas de enlace de LINGO, tales como por ejemplo anticuerpos monoclonales o fragmentos Fab de estos, y el uso de tales moléculas de enlace para tratar pacientes con lesiones a su sistema central nervioso.

Antecedentes de la invención

La recuperación funcional después de una lesión al sistema nervioso central (SNC) de los vertebrados superiores adultos se limita excepcionalmente, resultando en déficits neurológicos persistentes tales como pérdida del movimiento de las extremidades y sensación. Hasta ahora, existe una carencia de una terapia efectiva para tratar humanos con lesiones del SNC tales como lesión de la médula espinal (LME) y lesión cortical cerebral. Aunque las neuronas del SNC adultas generalmente sobreviven a la axotomía, la regeneración axonal es transitoria y sólo ocurre sobre una zona confinada, por lo tanto retardando la re-formación de contactos sinápticos relevantes funcionalmente. Adicionalmente, la capacidad plástica del SNC de adulto también se restringe, lo que dificulta la reorganización de rutas ilesas para compensar funcionalmente aquellas eliminadas por la lesión. Paradójicamente, los axones axotomizados en el sistema nervioso periférico (SNP) tienen una alta capacidad para regenerarse a grandes distancias y con frecuencia establecen conexiones funcionalmente significativas (Schwab (2004) Curr Opin Neurobiol 14,118-124). Esta restricción en regeneración axonal/plasticidad, se debe en parte a que la expresión en oligodendrocitos mielinizantes de varias proteínas han demostrado ser potentes inhibidores del crecimiento neurítico, a saber Nogo-A (Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre et al. (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384), glicoproteína asociada a la mielina (MAG), y glicoproteína de la mielina del oligodendrocito (OMgp) (McKerracher et al. (1994) Neuron 13, 805-811; Wang et al. (2002) Nature 417:941-944) (Fig. 1A). Nogo-A contiene dominios inhibidores del crecimiento neurítico múltiple expuestos en la superficie de los oligodendrocitos: dos se localizan dentro de la región amino-terminal (amino-Nogo-A) y uno en la región C-terminal (Nogo-66) (Oertle et al. (2003) J Neurosci 23, 5393-5406). Nogo-66 se une y da la señal a través de un receptor que contiene repeticiones ricas en leucina (LRR) ancladas a glicosil-fosfatidilinositol (GPI) en la superficie neuronal conocida como el receptor Nogo-66 (NgR) (Fournier et al. (2001) Nature 409, 341-346). Aunque MAG y OMgp, estructuralmente no relacionadas, también se unen y dan la señal a NgR (Domeniconi et al. (2002) Neuron 35, 283290; Liu et al. (2002) Science 297, 1190-1193; Wang et al. (2002) Nature 417:941-944). La señalización a NgR lleva a la activación de la GTPasa RhoA pequeña, que a su vez activa la quinasa asociada con Rho (ROCK) que conduce a una rigidización del citoesqueleto de la actina y la inhibición de la extensión axonal (Niederöst et al. (2002) J Neurosci 22, 10368-10376; Schweigreiter et al. (2004) Mol Cell Neurosci 27:163-174). Los tres ligandos se unen en la región LRR de NgR y tienen sitios de enlace parcialmente solapantes (Fournier et al. (2002) J Neurosci 22, 88768883; Liu et al. (2002) Science 297, 1190-1193; Wang et al. (2002) Nature 417:941-944; Barton et al. (2003) EMBO J 22, 3291-3302). El o los receptores de los dominios inhibidores dentro del amino-Nogo-A son desconocidos pero se ha demostrado que es distinto de NgR (Schweigreiter et al. (2004) Mol Cell Neurosci 27:163-174). También se ha encontrado que MAG da la señal a través de un homólogo cercano de NgR conocido como NgR2 (Pignot et al. (2003) J Neurochem 85, 717-728; Venkatesh et al. (2005) J Neurosci 25, 808-822).

Como NgR carece de un dominio citoplásmico, utiliza varias proteínas transmembrana de la transducción de la señal, a saber el receptor de la neurotrofina de baja afinidad p75NTR, TROY (a.k.a. TAJ) y LINGO-1 (LRR y proteína que interactúa con el receptor Nogo, que contiene el dominio Ig a.k.a LRRN6A o LERN1) (Wang et al. (2002) Nature 420, 74-78; Carim-Todd et al. (2003) Eur J Neurosci 18, 3167-3182; Mi et al. (2004) Nat Neurosci 7, 221-228; Park et al. (2005) Neuron 45:345-351; Shao et al. (2005) Neuron 45, 353-359). TROY y p75NTR se pueden reemplazar uno por el otro en el complejo del receptor NgR, mientras que la presencia de LINGO-1 es un prerequisito absoluto para que la señalización se produzca. El complejo del receptor NgR, por lo tanto se ve como un completo ternario que comprende NgR como la subunidad de enlace del ligando y LINGO-1 como la subunidad de transducción de la señal común que actúa en combinación con cualquiera p75NTR o TROY.

LINGO-1 es una proteína transmembrana única expresada exclusivamente dentro del SNC predominantemente en las neuronas y oligodendrocitos. La expresión de picos de LINGO-1 en el periodo postnatal temprano y se favorece la expresión en la médula espinal adulta después de la lesión. El ectodominio de LINGO-1 contiene doce LRRs en tándem flanqueadas por los subdominios N-y C-terminal seguidos por una región básica y un dominio Ig (Fig. 1B). Teniendo en cuenta que una fusión AP del Ectodominio LINGO-1 unida a las células COS-7 que expresan NgR o p75NTR o ambas y, de manera análoga, LINGO-1 se co-precipita con NgR o p75NTR en las células que expresan las tres proteínas, LINGO-1 más probablemente forma un complejo ternario con NgR y p75NTR mediante la interacción con ambas simultáneamente.

Además de ser expresada en neuronas, LINGO-1 también se expresa en oligodendrocitos en el SNC de adulto (Mi et al. (2005) Nat Neurosci 8, 745-751). Inhibiendo la señalización de LINGO-1 en cultivos de oligodendrocitos mediante ya sea el tratamiento con LINGO-1-Fc, se reduce la expresión de la proteína con ARNi o por la sobreexpresión de DN-LINGO-1 aumentó la diferenciación de OPCs con oligodendrocitos mielinizantes. Adicionalmente, la ablación genética de LINGO-1 en ratones aumenta el número de oligodendrocitos maduros y, según el caso, los axones mielinizados en la médula espinal. La inhibición de señalización de LINGO-1 redujo la activación de RhoA y aumentó la actividad de Fyn quinasa, de las cuales ambas se reportan por promover la diferenciación de oligodendrocitos, aunque los ligandos/interacciones actuales responsables para activar la señalización de LINGO-1 aún no se han ejemplificado. Esto ha llevado a la conclusión de que LINGO-1 es un regulador negativo de mielinización.

La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria crónica del SNC caracterizada por la desmielinización y degeneración axonal que conduce a déficits neurológicos múltiples. Aunque la remielinización de los axones puede ocurrir temprano en la enfermedad, en algún punto la remielinización cae completamente, lo que conduce a la degeneración axonal acelerada y a un daño irreversible. La remielinización más probablemente se origina de la diferenciación de células precursoras de oligodendrocito adultas (OPCs) que migran a las márgenes de lesiones activas. Como LINGO-1 regula negativamente la mielinización, el bloqueo de LINGO-1 puede aumentar la remielinización, atenuar la degeneración axonal, promover la regeneración axonal y de esta manera atenuar, detener o incluso revertir el progreso de enfermedades desmielinizantes tales como MS.

También se ha demostrado que el bloqueo de LINGO-1 mejora la supervivencia de neuronas dopaminérgicas y reduce las anormalidades del comportamiento en modelos de roedores de la enfermedad de Parkinson (Inoue et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104, 14430-14435). También se ha demostrado que los antagonistas de LINGO-1 promueven la recuperación funcional y el brote axonal después de la lesión de la médula espinal (Ji et al., 2006, Mol. Cell Neurosc. 33: 311-320). WO 2006/00247 además revela métodos para tratar enfermedades incluyendo la esclerosis múltiple utilizando antagonistas de LINGO-1. Los anticuerpos contra NogoR se describen en US 2005/0214288.

Resumen de la invención

En la actualidad se ha encontrado sorprendentemente que novedosos anticuerpos humanos monoclonales contra LINGO-1 (conocidos como anticuerpo 4784, y anticuerpo 4785 de ahora en adelante) inhiben significantemente la asociación de LINGO-1 con NgR y atenúan significantemente la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal de rata adulta a concentraciones sub-nM in vitro. Además, los citados anticuerpos aumentan significantemente la diferenciación de oligodendrocitos primarios in vitro y se ha demostrado que inhibe la expresión significantemente de la superficie celular de la LINGO-1 en células vivas. Se espera que el tratamiento... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de enlace que es capaz de unirse a la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, con una constante de disociación <1000nM, y que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia las siguientes CDRs: cualquiera de las dos,

(i) CDR-H1 de SEQ ID NO:12, CDR-H2 de SEQ ID NO:13, CDR-H3 de SEQ ID NO:14, CDR-L1 de SEQ ID NO: 15, CDR-L2 de SEQ ID NO:16 y CDR-L3 de SEQ ID NO:17, o,

(ii) CDR'-H1 de SEQ ID NO:18, CDR'-H2 de SEQ ID NO:19, CDR'-H3 de SEQ ID NO:20, CDR'-L1 de SEQ ID NO:21, CDR'-L2 de SEQ ID NO:22 y CDR'-L3 de SEQ ID NO:23.

2. Una molécula de enlace que es capaz de unirse a la proteína de acuerdo con SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, o SEQ ID NO:3, con una constante de disociación <1000nM, y que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende en secuencia las regiones variables de cadena pesada y ligera que son cualquiera

(i) al menos 50% idénticas a las regiones variables de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5 respectivamente, o,

(ii) al menos 50% idénticas a las regiones variables de cadena pesada y ligera de SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7 respectivamente.

3. La molécula de enlace de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que es capaz de atenuar la actividad inhibidora del crecimiento neurítico de mielina de la médula espinal a una concentración de menos de 20nM.

4. La molécula de enlace de acuerdo con la reivindicación 1, 2, o 3, que es capaz de aumentar la longitud media de las neuritas por célula de las células granulares de cerebelo de rata, cultivadas sobre un sustrato de mielina de la médula espinal de rata adulta, por al menos 20%.

5. La molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es un anticuerpo o un fragmento de esta.

6. La molécula de enlace de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, que es un anticuerpo monoclonal humano o quimérico o humanizado.

7. La molécula de enlace de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que la parte constante o el fragmento de esta de la cadena pesada humana es del tipo 4 y la parte constante o el fragmento de esta de la cadena ligera humana es del tipo .

8. La molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 5-7, seleccionada del grupo que consiste de: cualquiera,

(i) un anticuerpo que comprende la parte variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:4 y la parte variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:5, o

(ii) un anticuerpo que comprende la parte variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:6 y la parte variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:7

9. Un polinucleótido que codifica una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9; o del grupo que consiste de SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

11. Un vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10.

12. Un sistema de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en donde dicho sistema de expresión o parte de esta es capaz de producir una molécula de enlace de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, cuando dicho sistema de expresión o parte de esta, está presente en una célula huésped compatible.

13. Una célula huésped aislada que comprende un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 12.

14. Una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para utilizar como un medicamento.

15. Una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para utilizar en el tratamiento 5 de una lesión del SNC.

16. El uso de una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión del SNC.

17. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, junto con al menos un portador o diluente farmacéuticamente aceptable.

10 18. Una composición farmacéutica de la reivindicación 17, que comprende un anticuerpo de la Reivindicación 8.