ANTICUERPOS CONTRA PD-1 Y SUS USOS.

Campo de la invención [0001] El campo técnico se refiere a la modulación de las respuestas inmunitarias reguladas por el receptor de la muerte programada 1 (PD-1). Antecedentes de la intención ES 2 367 430 T3 [0002] Una respuesta inmunitaria adaptativa supone la activación, selección, y proliferación clonal de dos clases principales de linfocitos denominados células T y células B. Después de encontrarse con un antígeno, las células T proliferan y se diferencian en células efectoras específicas de antígeno, mientras que las células B proliferan y se diferencian en células que segregan anticuerpos. [0003] La activación de las células T es un proceso multietapa que requiere varios eventos de señalización entre la célula T y una célula presentadora de antígenos (APC). Para que se produzca la activación de la célula T, se deben proporcionar dos tipos de señales a una célula T en reposo. El primer tipo está mediado por el receptor de células T específicas de antígeno (TcR), y confiere especificidad a la respuesta inmunitaria. El segundo tipo, de estimulación simultánea, regula la magnitud de la respuesta y se proporciona mediante receptores accesorios sobre las células T. [0004] Se proporciona una señal de estimulación simultánea primaria mediante la activación del receptor CD28 tras el acoplamiento de sus ligandos B7-1 o B7-2. En contraste, el acoplamiento del receptor inhibidor CTLA-4 con los mismos ligandos B7-1 o B7-2 da como resultado la atenuación de la respuesta de las células T. Así, las señales de CTLA-4 antagonizan la estimulación simultánea mediada por CD28. A concentraciones de antígeno elevadas, la estimulación simultánea de CD28 anula el efecto inhibitorio de CTLA-4. La regulación temporal de la expresión de CD28 y CTLA-4 mantiene un equilibrio entre las señales de activación y de inhibición y asegura el desarrollo de una respuesta inmunitaria eficaz, mientras que al mismo tiempo protege contra el desarrollo de la autoinmunidad. [0005] Recientemente se han identificado los homólogos moleculares de CD28 y CTLA-4 y sus ligandos similares a B-7. ICOS es un receptor de estimulación simultánea similar a CD28. El receptor PD-1 (muerte programada 1) es un receptor inhibitorio y equivalente a CTLA-4. Esta descripción se refiere a la modulación de respuestas inmunitarias mediadas por el receptor PD-1. [0006] PD-1 es un receptor transmembrana de tipo I de 50-55 kDa que fue identificado originalmente en una línea de células T que experimentan la apoptosis inducida por activación. PD-1 se expresa en células T, células B, y macrófagos. Los ligandos para PD-1 son los miembros de la familia B7, PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (B7-DC). [0007] PD-1 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) que contiene un solo dominio Ig de tipo V en su región extracelular. El dominio citoplasmático de PD-1 contiene dos tirosinas, con la tirosina más próxima a la membrana (VAYEEL en PD-1 de ratón) localizada en un ITIM (motivo inhibidor de un inmuno-receptor basado en tirosina). La presencia de un ITIM en PD-1 indica que esta molécula funciona para atenuar la señalización del receptor de antígenos por reclutamiento de fosfatasas citoplasmáticas. Las proteínas PD-1 humanas y murinas comparten una identidad en aminoácidos del 60% aproximadamente con la conservación de sitios de N-glicosilación potenciales, y restos que definen el dominio Ig-V. El ITIM que se encuentra en la región citoplasmática y el motivo similar a ITIM que rodea la tirosina carboxi-terminal (TEYATI en seres humanos y en ratón) también están conservados entre los ortólogos humanos y murinos. [0008] PD-1 se expresa en células T, células B, y monocitos activados. Los datos experimentales relacionan las interacciones de PD-1 con sus ligandos en la regulación por defecto de las respuestas inmunitarias centrales y periféricas. En particular, la proliferación en células T de tipo silvestre se inhibe en presencia de PD-L1, pero no en células T deficientes en PD-1. Además, ratones deficientes en PD-1 presentan un fenotipo autoinmunitario. La deficiencia de PD-1 en ratones C57BL/6 da como resultado una glomerulonefritis y una artritis similar al lupus crónico progresivo. En ratones Balb/c, la deficiencia en PD-1 da lugar a cardiomiopatías severas debido a la presencia de anticuerpos auto-reactivos específicos del tejido cardiaco. Agata y col. (1996) describe un anticuerpo que se une al PD-1 de ratón. El documento WO 02/078731 describe la secuencia del PD-1 humano y anticuerpos que inhiben la interacción entre PD-L1 y PD-1. 2 [0009] En general, existe la necesidad de proporcionar procedimientos terapéuticos seguros y efectivos para trastornos inmunitarios tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios, alergias, rechazo de trasplantes, cáncer, deficiencias inmunitarias, y otros trastornos relacionados con el sistema inmunitario. La modulación de las respuestas inmunitarias involucradas en estos trastornos se puede conseguir con la manipulación de la vía del PD-1. SUMARIO DE LA INVENCIÓN ES 2 367 430 T3 [0010] La presente descripción proporciona anticuerpos que pueden actuar como agonistas y/o antagonistas de PD-1, modulando así las respuestas inmunitarias reguladas por PD-1. La descripción además proporciona anticuerpos contra PD-1 que comprenden nuevos fragmentos de unión a antígenos. Los anticuerpos contra PD-1 de la invención son capaces de (a) unirse específicamente a PD-1, incluyendo el PD-1 humano; (b) bloquear las interacciones de PD-1 con su(s) ligando(s) natural(es); o (c) desempeñar ambas funciones. Además, los anticuerpos pueden tener propiedades inmunomoduladoras, es decir, pueden ser eficaces en la modulación de la regulación por defecto asociada a PD-1 de respuestas inmunitarias. Dependiendo del procedimiento de uso y el efecto deseado, los anticuerpos se pueden usar para potenciar o inhibir respuestas inmunitarias. [0011] Las formas de realización ilustrativas de los anticuerpos se denominan PD1-17, PD1-28, PD1-33, PD1­ 35, y PD1-F2. Otras formas de realización comprenden un dominio VH y/o VL del fragmento Fv de PD1-17, PD1-28, PD1-33, PD1-35, o PD1-F2. Formas de realización adicionales comprenden una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cualquiera de estos dominios VH y VL. Otras formas de realización comprenden un fragmento H3 del dominio VH de PD1-17, PD1-28, PD1-33, PD1-35, o PD1-F2. [0012] La descripción también proporciona composiciones que comprenden anticuerpos PD-1, y su uso en procedimientos de modulación de la respuesta inmunitaria, incluyendo procedimientos para el tratamiento de seres humanos o animales. En formas de realización particulares, los anticuerpos contra PD-1 se usan para tratar o prevenir trastornos inmunitarios incrementando o reduciendo la respuesta de las células T mediada por TcR/CD28. Los trastornos susceptibles al tratamiento con las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, diabetes de tipo I, rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra hospedador, trastornos inmunitarios hiperproliferativos, cáncer, y enfermedades infecciosas. [0013] Además, los anticuerpos contra PD-1 se pueden usar en diagnosis para detectar PD-1 o sus fragmentos en una muestra biológica. La cantidad de PD-1 detectada puede estar relacionada con el nivel de expresión de PD-1, que a su vez, está relacionado con el estado de activación de las células inmunitarias (por ejemplo, células T, células B, y monocitos activados) en el sujeto. [0014] La descripción también proporciona ácidos nucleicos aislados, que comprenden una secuencia que codifica un dominio VH o VL procedente del fragmento Fv de PD1-17, PD1-28, PD1-33, PD1-35, o PD1-F2. También se proporcionan ácidos nucleicos aislados, que comprenden una secuencia que codifica una o más CDRs procedente de cualquiera de los dominios VH y VL descritos en el presente documento. La descripción también proporciona vectores y células hospedadoras que comprenden dichos ácidos nucleicos. [0015] La descripción adicionalmente proporciona un procedimiento de producción de nuevos dominios VH y 45 VL y/o anticuerpos funcionales que comprenden todos o una parte de dichos dominios derivados de los dominios VH o VL de PD1-17, PD1-28, PD1-33, PD1-35, o PD1-F2. [0016] Aspectos adicionales de la exposición se desarrollarán en parte en la siguiente descripción, y en parte serán obvios a partir de la descripción, o se pueden conocer poniendo en práctica la invención. La invención se desarrolla y se concreta particularmente en las reivindicaciones anexas, y la presente exposición no se debe interpretar en ningún modo como una limitación del alcance de las reivindicaciones.... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que comprende: Un dominio VH que comprende 3 CDRs; y un dominio VL que comprende 3 CDRs; en el que el anticuerpo comprende CDRs que tienen las secuencias de: (a) SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25; y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28; o (b) SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31; y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34; o (c) SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40; en el que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo dentro del dominio extracelular del PD-1 humano. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1 (a) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; o el anticuerpo de la reivindicación 1 (b) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; o el anticuerpo de la reivindicación 1 (c) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1 (a), que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; o el anticuerpo de la reivindicación 1 (b), que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; o el anticuerpo de la reivindicación 1 (c), que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. 4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de PD-1 con una constante de afinidad superior a 10 7 M -1 . 5. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo inhibe la unión de PD-L a PD-1 con una CI50 inferior a 10 nM. 6. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es una Fab, F(ab')2, Fv, scFv. 7. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es humano. 8. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es IgG1 o IgG4. 9. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es IgG1 o IgG1. 10. El anticuerpo de la reivindicación 1(a), en el que el anticuerpo comprende un dominio VH de la SEQ ID NO: 6 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 8; o el anticuerpo de la reivindicación 1(b) en el que el anticuerpo comprende un dominio VH de la SEQ ID NO: 10 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 12; o el anticuerpo de la reivindicación 1(c) en el que el anticuerpo comprende un dominio VH de la SEQ ID NO: 14 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 16. 11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1. 12. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 anteriores en la preparación de un medicamento. 13. El uso de la reivindicación 12, en el que el medicamento es para el tratamiento o la prevención de un trastorno seleccionado del grupo constituido por un trastorno autoinmunitario, una respuesta inmunitaria a un injerto, una reacción alérgica, y cáncer. 14. El uso de la reivindicación 12 ó 13, en el que el medicamento es para su administración a un ser humano. 15. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1. 16. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 15. 52 ES 2 367 430 T3 17. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 16. 18. La célula hospedadora de la reivindicación 17, en la que la célula hospedadora se selecciona entre: una bacteria E. coli, una célula de ovario de hámster chino, una célula HeLa, y una célula NS0. 19. El ácido nucleico de la reivindicación 15, en el que el ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16. 20. El ácido nucleico de la reivindicación 19, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15. 21. Un procedimiento de preparación de un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo dentro del dominio extracelular del PD-1 humano, en el que el procedimiento comprende: (a) la proporción de un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio variable que incluye una CDR3 a reemplazar o que carece de una región que codifica CDR3; (b) la combinación del repertorio con un ácido nucleico donador que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en la SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 37, de manera que el ácido nucleico donador se inserta en la región CDR3 en el repertorio, para así proporcionar un repertorio producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio variable; (c) la expresión de los ácidos nucleicos del repertorio producto; (d) la selección de un fragmento de unión al antígeno que se une específicamente a PD-1; y (e) la recuperación del fragmento de unión al antígeno específico o al ácido nucleico que codifica el fragmento de unión. 22. Un anticuerpo producido mediante el procedimiento de la reivindicación 21. 23. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 22 en la fabricación de un medicamento para la modulación de una respuesta inmunitaria adaptativa. 24. El uso de la reivindicación 23, en el que el medicamento modula una respuesta de células T, células B, o monocitos. 25. El uso de la reivindicación 23, en el que el anticuerpo es como en la reivindicación 1. 26. El uso de la reivindicación 23, en el que el anticuerpo es como en la reivindicación 22. 27. El uso de la reivindicación 23, en el que el anticuerpo está inmovilizado sobre una matriz o reticulado. 28. El uso de la reivindicación 27, en el que la matriz de soporte comprende uno o más materiales seleccionados entre agarosa, dextrano, celulosa, PVDF, sílice, nailon, dacrón, poliestireno, poliacrilatos, polivinilos, teflones, ácido poliglicólico, polihidroxialcanoato, colágeno, y gelatina. 29. El uso de la reivindicación 23, en el que el anticuerpo contra PD-1 modula una respuesta celular inmunitaria mediada por una señal de un receptor de antígenos. 30. El uso de la reivindicación 29, en el que la señal del receptor de antígenos es presentada simultáneamente con el anticuerpo contra PD-1. 31. El uso de la reivindicación 29, en el que la señal del receptor de antígenos y el anticuerpo contra PD-1 están separadas por no más de 100 µm. 32. El uso de la reivindicación 29, en el que la señal del receptor de antígenos es proporcionada por un anticuerpo contra CD3. 53 ES 2 367 430 T3 54 ES 2 367 430 T3 ES 2 367 430 T3 56 ES 2 367 430 T3 57 ES 2 367 430 T3 58 ES 2 367 430 T3 59 ES 2 367 430 T3 ES 2 367 430 T3 61 ES 2 367 430 T3 62