Un anticuerpo humano o humanizado aislado, que se une a cada uno de receptores asesinos similares a Ig (KIR) 2DL1,

KIR2DL2 y KIR2DL3, pero que no se une a KIR2DS4, y reduce, neutraliza o invierte la inhibición de la citotoxicidad de células NK mediada por estos KIRs

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos, así como a fragmentos y derivados de los mismos, que reaccionan de forma cruzada con y/o bloquean dos o más receptores KIR inhibitorios presentes en la superficie de células NK, y potencian la citotoxicidad de células NK en sujetos mamíferos o en una muestra biológica. La invención también se refiere a métodos para elaborar estos anticuerpos, fragmentos, variantes y derivados; composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos; y al uso de estas moléculas y composiciones, particularmente en terapia, para incrementar la actividad o citotoxicidad de células NK en los sujetos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células asesinas naturales (NK – siglas en inglés) son una sub-población de linfocitos, involucradas con la inmunidad y en el sistema de vigilancia inmunitaria del hospedador.

Las células NK son células mononucleares que se desarrollan en la médula ósea a partir de progenitores linfoides, y las características morfológicas y propiedades biológicas incluyen típicamente la expresión de los determinantes de diferenciación (CDs) CD16, CD56 y/o CD57; la ausencia del complejo TCR alfa/beta o gamma/delta en la superficie celular; la capacidad para unirse a y asesinar células diana que fallan en expresar “por sí mismas” el complejo principal de histocompatibilidad (MHC)/proteínas de antígeno de leucocitos humanos (HLA); y la capacidad de asesinar células tumorales u otras células enfermas que expresan ligandos para activar los receptores NK. Las células NK se caracterizan por su capacidad para unirse a y asesinar varios tipos de líneas de células tumorales, sin la necesidad de inmunización o activación previa. Las células NK también pueden liberar proteínas y citocinas solubles que ejercen un efecto regulador en el sistema inmunitario; y pueden ser sometidas a múltiples rondas de división celular y producir células hijas con propiedades biológicas similares como la célula parental. Tras la activación por interferones y/o citocinas, las células NK median en la lisis de células tumorales y de células infectadas con patógenos intracelulares por mecanismos que requieren contactos físicos directos entre la célula NK y la célula diana. La lisis de células diana implica la liberación de gránulos citotóxicos a partir de la célula NK sobre la superficie de la diana unida, y proteínas efectoras tales como perforina y granzima B que penetran en la membrana de plasma diana e inducen apoptosis o la muerte celular programada. Normalmente, las células sanas se protegen de la lisis por células NK.

En base a sus propiedades biológicas, se han propuesto diversas estrategias terapéuticas y de vacuna en la técnica, que se basan en una modulación de las células NK. Sin embargo, la actividad de las células NK se regula por un mecanismo complejo que implica señales tanto estimuladoras como inhibitorias.

En síntesis, la actividad lítica de células NK se regula por diversos receptores de la superficie celular que transducen señales intracelulares positivas o negativas tras la interacción con ligandos en la célula diana. El equilibrio entre las señales positivas y negativas transmitidas mediante estos receptores determina si se lisa (aniquila) o no una célula diana por parte de una célula NK. Las señales estimuladoras de células NK se pueden mediar por receptores naturales de citotoxicidad (NCR – siglas en inglés) tal como NKp30, NKp44 y NKp46; así como receptores NKG2C, receptores NKG2D, ciertos receptores asesinos similares a Igs (KIRs – siglas en inglés) activantes y otros receptores NK activantes (Lanier, Annual Review of Immumology 2005; 23:225-74). Las señales inhibitorias de células NK pueden ser mediadas por receptores tipo Ly49, CD94/NKG2A, así como ciertos KIRs inhibitorios, que reconocen moléculas del complejoprincipal de histocompatibilidad (MHC) clase I (Kärre et al., Nature 1986; 319:675-8; Öhlén et al., Science 1989;246:6668). Estos receptores inhibitorios se unen a determinantes polimórficos de las moléculas MHC de clase I (incluyendo HLA de clase I) presentes en otras células e inhiben la lisis mediada por células NK.

Los KIR, a los que algunas veces se alude también como receptores inhibitorios asesinos, se han caracterizado en seres humanos y primates no humanos, y son moléculas trans-membrana tipo I polimórficas presentes en ciertos sub-conjuntos de linfocitos, incluidas células NK y algunas células T. Los KIRs interactúan con determinantes en los dominios alfa 1 y 2 de las moléculas MHC de clase I y, como se describe anteriormente, distintos KIRs son estimuladores o inhibitorios para células NK.

La nomenclatura para los KIRs se basa en el número de dominios extracelulares (KIR2D y KIR3D que tienen dos y tres dominios Ig extracelulares, respectivamente) y si la cola citoplásmica es larga (KIR2DL o KIR3DL) o corta (KIR2DS o KIR3DS). La presencia o ausencia de un KIR determinado es variable de una célula NK a otra dentro de la población NK presente en un individuo único. Entre seres humanos también existe un nivel relativamente alto de polimorfismo de genes KIR, estando ciertos genes KIR presentes en algunos, pero no en todos los individuos. La expresión de alelos KIR en células NK se regula de forma estocástica, dando a entender que, en un individuo determinado, un linfocito determinado puede expresar uno, dos o más KIRs diferentes, dependiendo del genotipo del individuo. Las células NK de un individuo único expresan de forma típica diferentes combinaciones de KIRs, proporcionando un repertorio de células NK con diferentes especificidades para moléculas MHC de clase I.

Ciertos productos génicos de KIR provocan estimulación de la actividad de linfocitos cuando se unen a un ligando apropiado. Los KIRs activantes tienen todos una cola citoplásmica corta con un residuo transmembrana cargado que se asocia con una molécula adaptadora que tiene Motivos de Activación basados en Tirosina de Inmunorreceptor (ITAMs) que transducen señales estimuladoras a la célula NK. En contraposición, los KIRs inhibitorios tienen una cola citoplásmica larga que contiene el Motivo Inhibitorio basado en Tirosina de Inmunorreceptor (ITIM), que transducen señales inhibitorias a la célula NK tras acoplamiento de sus ligandos de MHC de clase I. Los KIRs inhibitorios conocidos inducen miembros de las sub-familias KIR2DL y KIR3DL. Los KIRs inhibitorios que tienen dos dominios Ig (KIR2DL) reconocen los alotipos HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente designado p58.2) y el producto génico alélico estrechamente relacionado, KIR2DL3 ambos reconocen alotipos HLA-C del “grupo 1” (incluyendo HLA-Cw1, -3, -7, y -8), mientras que KIR2DL1 (p58.1) reconoce alotipos HLA-C del “grupo 2” (tal como HLA-Cw2, -4, -5 y -6). El reconocimiento por KIR2DL1 viene dictado por la presencia de un residuo Lys en la posición 80 de los alelos HLA-C. El reconocimiento de KIR2DL2 y KIR2DL3 viene dictado por la presencia de un residuo Asn en la posición 80 en HLA-C. De manera importante, la gran mayoría de alelos HLA-C tienen ya sea un residuo Asn o un residuo Lys en la posición 80. Por lo tanto, KIR2DL1, -2 y -3 reconocen colectivamente de forma esencial todos los alotipos HLA-C encontrados en seres humanos. Un KIR tiene tres dominios Ig, KIR3DL1 (p70), reconoce un epítopo compartido por los alelos HLA-Bw4. Finalmente, KIR3DL2 (p140), un homodímero de moléculas con tres dominios Ig, reconoce HLA-A3 y –A11.

Aunque múltiples KIRs inhibitorios y/u otros receptores inhibitorios específicos de MHC de clase I (Moretta et al, Eur J Immunogenet. 1997;24(6):455-68; Valiante et al, Immunol Rev 1997;155:155-64; Lanier, Annu Rev Immunol 1998;16:359-93) pueden ser co-expresados por células NK, en cualquier repertorio de NK de individuos determinados que son células que expresan sólo un KIR individual y, de esta manera, son inhibidos sólo por alelos de MHC de clase I específicos (o alelos que pertenecen al mismo grupo de alotipos de MHC de clase I). Frecuentemente, a las moléculas de MHC de clase I humanas se las alude como antígeno de histocompatibilidad humano (HLA) clase I.

Las poblaciones de células NK o clones que están mal apareados con KIR-ligando con respecto a sus dianas, es decir, que expresan KIRs que no reconocen ninguna molécula de HLA de un hospedador, han demostrado que median en potentes respuestas anti-tumor, salvadoras de vidas, después de trasplante alogeneico de médula ósea en pacientes con leucemia (Ruggeri et al., Science 2002,295:2097-2100). El mecanismo fundamental se cree que es que el trasplante hematopoyético... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano o humanizado aislado, que se une a cada uno de receptores asesinos similares a Ig (KIR) 2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3, pero que no se une a KIR2DS4, y reduce, neutraliza o invierte la inhibición de la citotoxicidad de células NK mediada por estos KIRs.

2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que, además, no se une a KIR2DS3.

3. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que bloquea la unión de al menos uno de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 a una molécula de Antígeno de Leucocitos Humana (HLA)-C, clase I.

4. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que bloquea la unión de una molécula de HLA-Cw4 a KIR2DL1, y la unión de una molécula de HLA-Cw3 a al menos uno de KIR2DL2 o KIR2DL3.

5. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que potencia la actividad lítica de una célula asesina natural (NK) contra una célula diana humana que expresa una molécula de HLA-C, clase I.

6. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, en la unión a al menos uno de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3.

7. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que compite con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, en la unión a cada uno de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3.

8. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que comprende

(a) una secuencia de aminoácidos de la Región Determinante de la Complementariedad (CDR) 1 de cadena pesada que corresponde a los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 17;

(b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada que corresponde a los residuos 50-65 de SEQ ID NO: 17;

(c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada que corresponde a los residuos 99-112 de SEQ ID NO: 17;

(d) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera que corresponde a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 15;

(e) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera que corresponde a los residuos 50-65 de SEQ ID NO: 15;

(f) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera que corresponde a los residuos 89-97 de SEQ ID NO:

15.

9. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

10. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

11. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que tiene una constante de disociación (Kd) para KIR2DL1 de no más de aproximadamente 0,45 nM.

12. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que tiene una Kd para KIR2DL3 de no más de aproximadamente 0,025 nM.

13. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que se une a un epítopo de KIR2DL1 que comprende sustancialmente los residuos de aminoácidos L38, R41, M44, F45, N46, D47, T48, L49, R50, I52, F64, D72, Y80, P87 e Y88.

14. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que bloquea la unión de una molécula de HLA-Cw4 a los residuos M44, F45 y D72 de la porción extracelular de KIR2DL1 (SEQ ID NO: 23).

15. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que es un anticuerpo monoclonal.

16. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que es un anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

17. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que es un anticuerpo de IgG4.

18. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, anticuerpo que es un anticuerpo humano.

19. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

20. Un vector, que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 19.

21. Una célula, que comprende el vector de la reivindicación 20.

22. Un método para producir de forma recombinante un anticuerpo anti-KIR, humano, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 20 bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-KIR.

23. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones 118, o el anticuerpo humano producido por el método de la reivindicación 22, en una cantidad efectiva para potenciar de forma detectable la citotoxicidad de células NK en un paciente, y un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, que comprende Polisorbato 80, sacarosa o una combinación de los mismos.

25. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones23 y 24, para uso en un sujeto en necesidad de la misma.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, en donde el sujeto es un paciente que padece cáncer.

27. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en donde el paciente está padeciendo un cáncer seleccionado de leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple y linfoma no de Hodgkin.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en donde el paciente está padeciendo un cáncer seleccionado de cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer pulmonar, cáncer de mama y melanoma maligno.

29. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, en donde el sujeto es un paciente que padece una enfermedad infecciosa.

30. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, que comprende, además, un agente terapéutico seleccionado de un agente inmunomodulador, un agente hormonal, un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico, un agente apoptótico, un segundo anticuerpo que se une a un KIR inhibitorio, un agente antiinfectivo, un agente de fijación a objetivo y un compuesto adjunto.

31. Uso del anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-18., o del anticuerpo humano producido por el método de la reivindicación 22, en la preparación de un medicamento para potenciar la actividad de células NK en un sujeto en necesidad del mismo.

32. El uso de la reivindicación 31, en donde el sujeto es un paciente que padece cáncer.

33. El uso de la reivindicación 32, en donde el paciente está padeciendo un cáncer seleccionado de leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple y linfoma no de Hodgkin.

34. El uso de la reivindicación 32, en donde el paciente está padeciendo un cáncer seleccionado de cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer pulmonar, cáncer de mama y melanoma maligno.

35. El uso de la reivindicación 31, en donde el sujeto es un paciente que padece una enfermedad infecciosa.