MOLÉCULAS DE ADN QUE CODIFICAN CANALES DE CLORURO REGULADOS POR L-GLUTAMATO DE RHIPICEPHALUS SANGUINEUS.

Una molécula de ácido nucleico purificada que codifica una proteína de canal GluCl de R.

sanguineus, en que dicha molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8

Campo de la invención.

La presente invención se refiere en parte a moléculas de ácido nucleico (polinucleótidos) aisladas que codifican canales de cloruro regulados por glutamato de Rhipicephalus sanguineus (garrapata marrón del perro). La presente invención se refiere también a vectores recombinantes y hospedadores recombinantes que contienen un fragmento de ADN que codifica canales de cloruro regulados por glutamato de R. sanguineus, formas sustancialmente purificadas de canales de cloruro regulados por glutamato de R. sanguineus asociados y fracciones de membrana recombinantes que comprenden estas proteínas, proteínas mutantes asociadas y a procedimientos asociados con la identificación de compuestos que modulan canales de cloruro regulados por glutamato de R. sanguineus asociados, que serán útiles como insecticidas.

Antecedentes de la invención.

Los canales de cloruro regulados por glutamato o receptores H se han identificado en los nervios y músculos de artrópodos (Lingle y col., 1981, Brain Res. 212: 481-488; Horseman y col., 1988, Neurosci. Lett. 85: 6570; Wafford y Sattelle, 1989, J. Exp. Bio. 144: 449-462; Lea y Usherwood, 1973, Comp. Gen. Pharmacol. 4: 333-350; Cull-Candy, 1976, J. Physiol. 255: 449-464).

Los canales de cloruro regulados por glutamato de invertebrados son dianas importantes para los compuestos antihelmínticos e insecticidas de la clase de la avermectina, de amplio uso. Las avermectinas son una familia de lactonas macrocíclicas aisladas originalmente del actinomiceto Streptomyces avermitilis. El derivado semisintético de la avermectina, ivermectina (22,23-dihidroavermectina B1a) se usa en todo el mundo para el tratamiento de helmintos parásitos y plagas de insectos del hombre y los animales. Las avermectinas siguen siendo los endectocidas de amplio espectro más potentes con baja toxicidad para el huésped. Después de muchos años de uso en el campo, sigue habiendo poca resistencia a la avermectina en la población de insectos. La combinación de un buen índice terapéutico y la baja resistencia sugiere que los canales de cloruro regulados por glutamato (GluCl) siguen siendo buenas dianas para el desarrollo de insecticidas.

Se han clonado canales de cloruro regulados por glutamato a partir del nematodo del suelo Caenorhabditis elegans (Cully y col., 1994, Nature 371: 707-711; véase también la patente de los EE. UU. n°

5.527.703 y Arena y col., 1992, Molecular Brain Research 15: 339-348) y de Ctenocephalides felis (pulga; véase el documento WO 99/07828).

Además, anteriormente se identificó un gen codificante de un canal de cloruro regulado por glutamato en Drosophila melanogaster (Cully y col., 1996, J. Biol. Chem. 271: 20187-20191; véase también la patente de los EE. UU n° 5.693.492).

A pesar de la identificación de los clones de ADNc mencionados anteriormente que codifican canales GluCl, sería ventajoso identificar genes adicionales codificantes de canales GluCl en R. sanguineus con el fin de permitir una mejora del cribado para identificar nuevos moduladores de los canales GluCl que puedan tener actividad insecticida, acaricida y/o nematocida para la salud animal, especialmente en relación con el tratamiento de infestaciones de garrapatas y ácaros en perros, gatos, ganado, ovejas y otros animales importantes para la agricultura. La presente invención se enfrenta a estas necesidades y las satisface desvelando nuevos genes que expresan un canal GluCl1 de R. sanguineus y un canal GluCl2 de R. sanguineus, en que la expresión de estos ARN de GluCl de R. sanguineus en ovocitos de Xenopus o en otras células hospedadoras adecuadas resulta en un canal GluCl activo. La expresión heteróloga de un canal GluCl de la presente invención permitirá el análisis farmacológico de compuestos activos contra especies de invertebrados parásitos importantes para la salud animal o humana, especialmente en el tratamiento de infestaciones de garrapatas en perros y gatos. Las líneas celulares heterólogas que expresan un canal GluCl activo pueden usarse para establecer ensayos funcionales o de unión para identificar nuevos moduladores de los canales GluCl que pueden ser útiles en el control de los grupos de especies mencionados anteriormente.

Resumen de la invención.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada o purificada que codifica una nueva proteína de canal GluCl1 del invertebrado Rhipicephalus sanguineus (garrapata marrón del perro). Las moléculas de ADN desveladas en este documento pueden transfectarse en una célula hospedadora elegida, en que la célula hospedadora recombinante proporciona una fuente de cantidades sustanciales de un canal iónico regulado por ligando (LGIC) expresado y funcional, simple, homomultimérico o heteromultimérico. Es posible que tales canales iónicos funcionales regulados por ligando respondan a otros ligandos conocidos, los cuales, a su vez, proporcionarán dianas de cribado adicionales para identificar moduladores de estos canales, moduladores que pueden actuar como tratamiento insecticida, miticida y/o nematocida eficaz para su uso en la salud animal y humana y/o en la protección de los cultivos.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada y purificada que codifica una nueva proteína de canal GluCl2 del invertebrado Rhiphicephalus sanguineus.

La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada que codifica un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl1 de Rhiphicephalus sanguineus, en que esta molécula de ADN comprende la secuencia nucleotídica desvelada en este documento como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5.

La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada que codifica un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl2 de Rhiphicephalus sanguineus, en que esta molécula de ADN comprende la secuencia nucleotídica desvelada en este documento como SEQ ID NO:7.

En este documento se desvelan fragmentos o mutantes biológicamente activos de SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7 que codifican un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl1 o GluCl2 del invertebrado Rhiphicephalus sanguineus, respectivamente. Cualquiera de estos fragmentos y/o mutantes biológicamente activos codificará una proteína o un fragmento de proteína que mimetiza, al menos sustancialmente, las propiedades farmacológicas de una proteína de canal GluCl de R. sanguineus, incluyendo, pero sin limitarse a las proteínas de canal GluCl1 de R. sanguineus según se exponen en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, así como la respectiva proteína de canal GluCl2 según se expone en SEQ ID NO:8. Cualquiera de estos polinucleótidos incluye, pero no se limita necesariamente a sustituciones, deleciones y adiciones nucleotídicas, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales, de modo que estas mutaciones codifican un ARNm que expresa un canal GluCl de R. sanguineus funcional en una célula eucariota, como los ovocitos de Xenopus, de manera que son útiles para el cribado en busca de agonistas y/o antagonistas de la actividad de GluCl de R. sanguineus.

En este documento se desvelan las secuencias de la figura 1 (SEQ ID NO:1; designada T12), la figura 3 (SEQ ID NO:3; designada T82) y la figura 5 (SEQ ID NO:5; designada T32) que codifican nuevas proteínas GluCl1 de Rhiphicephalus sanguineus y de la figura 7 (SEQ ID NO:7, designada B1) que codifica una nueva proteína GluCl2 de Rhiphicephalus sanguineus.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN), como ADN genómico o ADN complementario (ADNc), que puede ser de cadena sencilla (hebra codificante o no codificante) o doble, así como ADN sintético, tal como un polinucleótido sintetizado de cadena sencilla. La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención puede incluir también una molécula de ácido ribonucleico (ARN).

La presente invención se refiere también a vectores recombinantes y a células hospedadoras recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas desveladas en esta memoria descriptiva.

La presente invención se refiere también a una forma sustancialmente purificada de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que comprende la secuencia de aminoácidos desvelada en la figura 2 (SEQ ID NO:2), la figura 4... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico purificada que codifica una proteína de canal GluCl de R. sanguineus, en que dicha molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8.

2. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus, en que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:2.

3. Un vector de expresión para expresar una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante, en que dicho vector de expresión comprende una molécula de ADN de la reivindicación

2.

4. Una célula hospedadora que expresa una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus recombinante, en que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 3.

5. Un procedimiento para la expresión de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante que comprende:

(a) la transfección del vector de expresión de la reivindicación 3 en una célula hospedadora adecuada;

(b) el cultivo de las células hospedadoras de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus a partir de dicho vector de expresión.

6. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:1.

7. La molécula de ADN de la reivindicación 6 que consta de la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 331 al nucleótido 1.683 de SEQ ID NO:1.

8. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus, en que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:4.

9. Un vector de expresión para expresar una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante, en que dicho vector de expresión comprende una molécula de ADN de la reivindicación

8.

10. Una célula hospedadora que expresa una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus recombinante, en que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Un procedimiento para la expresión de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante que comprende:

(a) la transfección del vector de expresión de la reivindicación 10 en una célula hospedadora adecuada;

(b) el cultivo de las células hospedadoras de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus a partir de dicho vector de expresión.

12. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:3.

13. La molécula de ADN de la reivindicación 12 que consta de la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 502 al nucleótido 1.854 de SEQ ID NO:3.

14. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus, en que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:6.

15. Un vector de expresión para expresar una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante, en que dicho vector de expresión comprende una molécula de ADN de la reivindicación

14.

16. Una célula hospedadora que expresa una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus recombinante, en que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 15.

17. Un procedimiento para la expresión de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula

hospedadora recombinante que comprende:

(a) la transfección del vector de expresión de la reivindicación 16 en una célula hospedadora adecuada;

(b) el cultivo de las células hospedadoras de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus a partir de dicho vector de expresión.

18. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:5.

19. La molécula de ADN de la reivindicación 18 que consta de la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 617 al nucleótido 2.170 de SEQ ID NO:5.

20. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus, en que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:8.

21. Un vector de expresión para expresar una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante, en que dicho vector de expresión comprende una molécula de ADN de la reivindicación

20.

22. Una célula hospedadora que expresa una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus recombinante, en que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 21.

23. Un procedimiento para la expresión de una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante que comprende:

(a) la transfección del vector de expresión de la reivindicación 21 en una célula hospedadora adecuada;

(b) el cultivo de las células hospedadoras de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus a partir de dicho vector de expresión.

24. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus que consta de una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:7.

25. La molécula de ADN de la reivindicación 24 que consta de la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 131 al nucleótido 1.387 de SEQ ID NO:7.

26. Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus sustancialmente sin otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:2.

27. Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus de la reivindicación 26 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.

28. Una preparación de membrana sustancialmente pura que comprende la proteína de canal GluCl1 de

R. sanguineus purificada a partir de la célula hospedadora recombinante según se define en la reivindicación 27.

29. Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus sustancialmente sin otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:4.

30. Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus de la reivindicación 29 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.

31. Una preparación de membrana sustancialmente pura que comprende la proteína de canal GluCl1 de

R. sanguineus purificada a partir de la célula hospedadora recombinante según se define en la reivindicación 30.

32. Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus sustancialmente sin otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:6.

33. Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus de la reivindicación 32 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.

34. Una preparación de membrana sustancialmente pura que comprende la proteína de canal GluCl1 de

R. sanguineus purificada a partir de la célula hospedadora recombinante según se define en la reivindicación 33.

35. Una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus sustancialmente sin otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:8.

36. Una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus de la reivindicación 35 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.

37. Una preparación de membrana sustancialmente pura que comprende la proteína de canal GluCl2 de

R. sanguineus purificada a partir de la célula hospedadora recombinante según se define en la reivindicación 36.

38. Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de las secuencias de aminoácidos según se exponen en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6.

39. Una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus que consta de una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:8.

40. Un procedimiento para identificar un modulador de una proteína de canal GluCl que comprende:

(a) la puesta en contacto de un compuesto de prueba con una proteína de canal GluCl de R. sanguineus seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 y SEQ ID N:8

(b) la medida del efecto del compuesto de prueba sobre la actividad de la proteína de canal GluCl.

41. El procedimiento de la reivindicación 40, en que la proteína GluCl de R. sanguineus de la etapa (a) es un producto de un vector de expresión de ADN contenido en una célula hospedadora recombinante.

42. Un procedimiento para identificar un compuesto que module la actividad de las proteínas de canal reguladas por glutamato que comprende:

(a) la inyección en una disolución de células hospedadoras de una población de moléculas de ácido nucleico, de las cuales, al menos una parte codifica una proteína de canal GluCl de R. sanguineus seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:8, de modo que la expresión de dicha parte de moléculas de ácido nucleico resulta en un canal regulado por glutamato activo;

(b) la adición de un compuesto de prueba a dicha disolución;

(c) la medida de la corriente de membrana de la célula hospedadora a un potencial de fijación más positivo que el potencial inverso para cloruro.

43. El procedimiento de la reivindicación 42, en que dicha molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consta de ADN complementario, ARN mensajero poli A+ y ARN complementario.