Método para la amplificación de alelos HLA Clase I.

Método para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra que comprende lassiguientes etapas:

(i) si es necesario, la liberación, aislamiento y/o concentración de los ácidos nucleicos presentes en dichamuestra;

(ii) amplificación separada locus-específica, del exón 2, exón 3 y exón 4 de los alelos HLA-B, haciendo uso de almenos tres conjuntos de cebadores, en donde:

- para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivolocus-específica en el intrón 2 de HLA-B;

-para la amplificación del exón 3, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivolocus-específica en el intrón 2 de HLA-B y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuenciaobjetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-B; y

-para la amplificación del exón 4, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivolocus-específica en el intrón 3 de HLA-B;

(iii) tipificación del alelo específico de HLA-B presente en dicha muestra.

Método para la amplificación de alelos HLA Clase I

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para la tipificación o subtipificación de HLA-B. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para la amplificación separada, locus-específica del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) está incluido dentro de aproximadamente 4 Mbp de ADN en el brazo corto del cromosoma 6 en 6p21.3 (Campbell y Trowsdale, 1993) . El MHC humano se divide en regiones de clase I, clase II y clase III. Los genes de clase I y clase II codifican moléculas de la superficie celular altamente polimórficas que se unen y presentan antígenos procesados en forma de péptidos a los linfocitos T, iniciando tanto las respuestas inmunes celulares como humorales.

Las moléculas clase I del MHC humano, HLA-A, -B, y -C, se encuentran en la mayoría de las células nucleadas. Son glicoproteínas de la superficie celular que se unen y presentan péptidos procesados derivados de las proteínas endógenamente sintetizadas de las células T CD8+. Estos heterodímeros consisten en una cadena α de HLA codificada asociada con un polipéptido monomórfico no MHC codificado β-microglobulina (Townsend y Bodmer, 1989; Spencer y Parham, 1996) . Las moléculas de clase II del MHC humano se codifican en la región HLA-D. Estas glicoproteínas de la superficie celular consisten en cadenas α-, y β- HLA- codificadas, asociadas como heterodímeros sobre la célula superficie de células presentadoras de antígenos tales como células B y macrófagos. Las moléculas de clase II sirven como receptores para péptidos procesados. Sin embargo, estos péptidos se derivan predominantemente de las proteínas de membrana y extracelular y se presentan a las células T CD4+. La región HLA-D contiene diversos genes clase II y tiene tres subregiones principales: HLA-DR, -DQ, y -DP. Tanto las regiones HLA-DQ como -DP contienen un gen funcional por cada una de sus cadenas α-y β-. La subregión HLA-DR contiene un gen funcional para la cadena α; el número de genes funcionales para la cadena β varía de uno a dos de acuerdo con el haplotipo (Andersson y otros, 1987; Apple y Erlich,

1996) .

Existe polimorfismo extensivo en la mayoría de los loci. En vista de la importancia biológica y médica de estos antígenos, se requiere una técnica altamente sensible y rápida para la tipificación de HLA. Una variedad de técnicas se usan actualmente para detectar el polimorfismo de HLA, incluyendo serológicas, bioquímicas, reconocimiento de células T y, más recientemente, los métodos de biología molecular.

La serología continua siendo el método soporte principal para la tipificación de HLA -especialmente de clase I- en muchos laboratorios de rutina de histocompatibilidad. El ensayo de micro-linfocitotoxicidad (Kissmeyer y otros, 1969; Terasaki y McClelland, 1964) es la aproximación estándar: células mononucleares viables de sangre periférica (clase I) o células B separadas (clase II) se mezclan con el antisuero (policlonal o monoclonal) de especificidad HLA conocida.

La detección del polimorfismo se puede lograr buscando en la diferente composición de aminoácidos de las moléculas de HLA a través de técnicas bioquímicas tal como focalización isoeléctrica unidimensional (IEF; Yang, 1987) . Este método descansa en las substituciones de aminoácidos que contribuyen a los cambios en la carga de la molécula de HLA.

Otro método de tipificación de HLA es la reacción mixta de linfocitos (MLR) . En conjunto con las observaciones que se realizan usando antisuero HLA-específico, se observó que los linfocitos procedentes de dos fuentes no relacionadas, pueen proliferar cuando se mezclan en el cultivo (Hirschom y otros, 1963) .

Los análisis de las especificidades de HLA a partir de ADN proporcionan un nuevo enfoque para definir sus diferencias polimórficas. En lugar de observar las diferencias en la molécula expresada, el polimorfismo se caracteriza a nivel de nucleótido.

Un desarrollo importante y poderoso en el campo de la biología molecular ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Mullis y otros, 1986; Mullis and Faloona, 1987) . En la tipificación de tejidos, se usa el PCR para amplificar las regiones polimórficas de genes HLA. Este producto HLA de PCR puede analizarse después por sus diferencias polimórficas, para establecer el tipo de tejido. Varios enfoques de este tipo se desarrollaron, incluyendo análisis heterodúplex de los productos de PCR (Clay y otros, 1994) , análisis corformacional del polimorfismo de simple cadena del producto de PCR (PCR-SSCP; Yoshida y otros, 1992) , ltipificación basada en la secuencia (SBT; Santamaria y otros, 1992 y 1993) , el uso de cebadores específicos de secuencia en la reacción de PCR (PCR-SSP; Olerup y Zetterquist, 1991) , el uso de PCR en combinación con el sondeo del oligonucleótido secuencia-específico (PCR-SSOP; Saiki y otros, 1986) o sondeo en membrana de transferencia puntual reversa (Saiki y otros, 1989) . Estos enfoques, usados simplemente o en combinación, se han aplicado como métodos basados en ADN para la tipificación de tejidos de especificidades de HLA clase I y clase II. Los métodos de tifipicación de ADN deben preferirse a los métodos serológicos proporcionados, siempre que está disponible un método de tipificación de ADN fácil, rápido y seguro. Algunas diferencias nivel de subtipo que son detectables por los métodos de ADN pueden no ser detectadas con los métodos actuales de tipificación serológica, aunque estas diferencias pueden provocar el rechazo del aloinjerto (Fleischhauer y otros, 1990) .

El sistema HLA es el sistema genético humano más polimórfico se conoce todavía. Los genes de HLA Clase I comparten una estructura similar (de 5' a 3') : una región de flanqueo no traducida en 5’, un primer exón (exón 1) que tiene una longitud de aproximadamente 73 pares de bases, un primer intrón (intrón 1) que tiene una longitud de aproximadamente 130 pares de bases, un segundo exón (exón 2) , que tiene una longitud de aproximadamente 250 pares de bases, un segundo intrón (intrón 2) , que tiene una longitud de aproximadamente 272 pares de bases, un tercer exón (exón 3) , que tienen una longitud de aproximadamente 276 pares de bases, un tercer intrón (intrón 3) , que tiene una longitud de aproximadamente 588 pares de bases y cuarto exón (exón 4) , que tiene un longitud de aproximadamente 276 pares de bases. Las sustituciones polimórficas dentro de los alelos HLA Clase I están ubicados principalmente tanto en el exón 2 como en el exón 3, que codifica la hendidura de unión del péptido de la molécula de clase I. Estos polimorfismos hacen diferenciación entre alelos alcanzables a través una variedad de técnicas de biología molecular tales como secuenciación o hibridación con sondas competentes. En los estuches de diagnóstico actuales el exón 2 y exón 3 se amplifican juntos, resultando en amplicones de aproximadamente 1 kb, que está formado por al menos el exón 2, intrón 2 y exón 3. Los cebadores locus-específico están disponibles para la amplificación de estos amplicones de 1 kb. Sin embargo, dichos amplicones grandes son difíciles de amplificar y mostrar la formación de estructura secundaria que resulta en la hibridación ineficiente de algunas sondas. Adicionalmente, debido a la aparición de nuevos alelos HLA-clase I, ciertas combinaciones de alelos no pueden distinguirse más sólo por la detección de polimorfismo en el exón 2 y el exón 3 y se requiere la tipificación adicional en el exón 4. Esto plantea la necesidad de la amplificación adicional del exón 4, lo que resulta en un amplicón aún más grande. Por lo tanto, una amplificación separada del exón 2, exón 3 y exón 4 puede desearse resultando en productos de amplificación que permiten una tipificación más eficiente de los alelos HLA Clase I. Sin embargo, como los sitios de hibridación de cebador locus-específico son escasos y no se pueden encontrar en el exón 2, exón 3 o exón 4, no es tan evidente la amplificación separada y locus-específica del exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-A, HLA -B y HLA -C.

Los métodos y estuches para la tipificación de HLA-B basada en la amplificación de los exones 2 y 3 se describen por ejemplo en WO 99/07 883 y WO 97/23 645. Los cebadores específicos para HLA-B se describen por ejemplo en EP-A-0 414 469, WO 97/20 197.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN

Es un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la amplificación separada locus-específica del exón 2, exón 3 y exón 4 de los alelos HLA-B.

1. Método para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra que comprende las siguientes etapas:

(i) si es necesario, la liberación, aislamiento y/o concentración de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;

(ii) amplificación separada locus-específica, del exón 2, exón 3 y exón 4 de los alelos HLA-B, haciendo uso de al menos tres conjuntos de cebadores, en donde:

-para la amplificación del exón 2, el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 de HLA-B; -para la amplificación del exón 3, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 2 de HLA-B y/o el cebador inverso se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-B; y -para la amplificación del exón 4, el cebador directo se hibrida específicamente a una secuencia objetivo locus-específica en el intrón 3 de HLA-B;

(iii) tipificación del alelo específico de HLA-B presente en dicha muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia objetivo locus-específica se sitúa en la posición 35 o 170 del intrón 2 de HLA-B (Fig. 2) y/o posición 42, 46, 65, 68, 96, 438, 502, 524, 547 o 571 del intrón 3 de HLA-B (Fig. 5) .

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2 caracterizado porque dichas posiciones constituyen el extremo 3' del cebador que se usa para la amplificación del exón 2, exón 3 o exón 4.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizado porque el cebador se selecciona a partir de la siguiente lista:

- para la amplificación del exón 2 de HLA-B (tabla 5) :

5'ACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 108) 5'AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 109) 5'CAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 110) 5'CCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 111) 5'MCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 112) 5'GMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 113) 5'YGMCCAACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 314)

- para la amplificación del exón 3 de HLA-B (Tabla 6; Tabla 7) : 5'CYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 114) 5'CCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 115) 5'GCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 116) 5'GGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 117) 5'CGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 118) 5'CCGGCCYGGGGCGSAGGTCACGACT3' (sec. con núm. de ident. 119) 5'CCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 120) 5'ACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 121) 5'TACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 122) 5'TTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 123) 5'TTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 124) 5'GTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 125) 5'CGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 222) 5'GCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 223) 5'CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 224) 5'CGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 225) 5'TCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 226) 5'CTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 227) 5'TCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 228) 5'TTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 229)

5'CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCCGSC3' (sec. con núm. de ident. 230) 5'TCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 231) 5'TTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 232) 5'CTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 233) 5'TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 234) 5'YTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 235) 5'CYTCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 236) 5'GATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 237) 5'TGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 238) 5'CTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 239) 5'GCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 240) 5'CGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 241) 5'GCGCTGATCCCATTTTCCTCYTCTT3' (sec. con núm. de ident. 242) 5'GCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 243) 5'CGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 244) 5'GCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 245) 5'AGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 246) 5'TAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 247) 5'CTAGCGCTGATCCCATTTTCCTCYT3' (sec. con núm. de ident. 248) 5'TCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 249) 5'CTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 250) 5'TCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 251) 5'TTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 252) 5'ATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 253) 5'CATTCTCCATTCAAGGGAGGGCGAC3' (sec. con núm. de ident. 254)

- para la amplificación del exón 4 de HLA-B (tabla 8) :

5'AGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 255) 5'GAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 256) 5'GGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 257) 5'AGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 258) 5'TAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 259) 5'ATAGGAGATTATCCCAGGTGCCTGC3' (sec. con núm. de ident. 260) 5'TGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 261) 5'GTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 262) 5'GGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 263) 5'AGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 264) 5'CAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 265) S'CCAGGTGTCCTGYCCATTCTCAGKC3' (sec. con núm. de ident. 266) 5'TCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 267) 5'GTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 268) 5'GGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 269) 5'TGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 270) 5'CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 271) 5'KCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 272) 5'GKCTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 273) 5'TSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 274) 5'GTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 275) 5'TGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 276) 5'GTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 277) 5'GGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 278) 5'GGGTGTSCCATGARAGATGCMAAGC3' (sec. con núm. de ident. 279) 5'GWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 280) 5'TGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 281) 5'CTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 282) 5'CCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 283) 5'GCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 284) 5'CGCCTGWAWTTTCTGACTCTTCCCA3' (sec. con núm. de ident. 285)

5. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con el siguiente cebador directo:

5'GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG3' (sec. con núm. de ident. 145) .

6. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con el siguiente cebador inverso:

5'TCGGCAGCCCCTCATGCTGT3' (sec. con núm. de ident. 312) .

7. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque:

-la amplificación del exón 2 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:

5'GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAG3' (sec. con núm. de ident. 145) y 5'AACCCGCGGGGATTTTGGCCTC3' (sec. con núm. de ident. 109) ;

-la amplificación del exón 3 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:

5'CGCGTTTACCCGGTTTCATTTTCAGTTG3' (sec. con núm. de ident. 224) y 5'TCTTCTCGTKGGAGSCCATCCCC3' (sec. con núm. de ident. 234) ;

-la amplificación del exón 4 se lleva a cabo con al menos el siguiente conjunto de cebadores:

S'TCACATGGGTGGTCCTAGG3' (sec. con núm. de ident. 267) y 5'TCGGCAGCCCCTCATGCTGT3' (sec. con núm. de ident. 312) .

8. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque tanto el exón 2 como el exón 3 de HLA-B se amplifican mediante el uso de una mezcla cebadora múltiple que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2 y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3.

9. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque todos los tres exones, exón 2, exón 3 y exón 4 de HLA-B se amplifican mediante el uso de una mezcla cebadora múltiple que contiene al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 2, al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 3 y al menos un par de cebadores para la amplificación del exón 4.

10. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque la etapa de tipificación se lleva a cabo por hibridación con una o más sondas adecuadas.

11. Un estuche de diagnóstico para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una muestra que comprende los siguientes componentes:

(i) cuando sea adecuado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;

(ii) una mezcla cebadora que contiene al menos:

- un conjunto cebador para la amplificación del exón 2 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 2 de los alelos HLA-B. -un conjunto cebador para la amplificación del exón 3 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 3 de los alelos HLA-B, y

- un conjunto cebador para la amplificación del exón 4 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 4 de los alelos HLA-B.

(iii) un medio para la tipificación del alelo específico de HLA-B presente en dicha muestra.

12. Un estuche de ensayo de sonda de línea para la tipificación o subtipificación de uno o más alelos HLA-B en una

muestra que comprende los siguientes componentes:

5 (i) cuando sea adecuado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra;

(ii) una mezcla cebadora que contiene al menos

10 - un conjunto cebador para la amplificación del exón 2 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la amplificación del exón 2 de los alelos HLA-B.

- un conjunto cebador para la amplificación del exón 3 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la

amplificación del exón 3 de los alelos HLA-B, y

15 - un conjunto cebador para la amplificación del exón 4 consistente de una combinación de un cebador directo y uno inverso como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para el uso en la

amplificación del exón 4 de los alelos HLA-B.

(iii) al menos una sonda que se hibrida específicamente con el exón 2, exón 3 o exón 4 de HLA-B, fijado a un

20 soporte sólido; (iv) un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;

(v) una solución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha solución;

(vi) cuando sea adecuado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación precedente.