Un procedimiento para el tipado de los alelos HLA-DRB1 *0820, HLA-DRB1*04new y/o HLA-DRB4*01new en unamuestra, definiéndose el exón 2 de dichos alelos por SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 50 y SEC ID Nº 67, respectivamente;

en el que dicho procedimiento comprende:

i) amplificar un fragmento que comprende todo o parte del exón 2 de dicho alelo usando al menos un paradecuado de cebadores;

ii) determinar la ausencia o presencia de los alelos HLA-DRB1*0820, HLA-DRB1*04new y/o HLADRB4*01new en la muestra.

Procedimiento para el tipado de alelos de HLA

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tipado de alelos del antígeno leucocitario humano (HLA) . Más particularmente, la presente invención se refiere al tipado de nuevos alelos de HLA.

Antecedentes de la invención

El complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) humano está contenido dentro de aproximadamente 4 Mpb de ADN en el brazo corto del cromosoma 6 en 6p21.3 (Campbell y Trowsdale, 1993) . El MHC humano se divide en las regiones de clase I, clase II y clase III. Los genes de la clase I y la clase II codifican moléculas de la superficie celular altamente polimórficas que se unen y presentan antígenos procesados en forma de péptidos a linfocitos T, iniciando respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales. Las moléculas de clase I, HLA-A, -B, y -C, se encuentran en la mayoría de las células nucleadas. Son glucoproteínas de la superficie celular que se unen y presentan péptidos procesados derivados de proteínas endógenamente sintetizadas a linfocitos T CD8+. Estos heterodímeros consisten en una cadena a codificada por HLA asociada a un polipéptido monomórfico codificado por no MHC, la ºmicroglobulina (Townsend y Bodmer, 1989; Spencer y Parham, 1996) . Las moléculas de clase II están codificadas en la región de HLA. Estas glucoproteínas de la superficie celular consisten en cadenas a y º codificadas por HLA asociadas como heterodímeros sobre la superficie celular de células presentadoras de antígeno tal como linfocitos B y macrófagos. Las moléculas de clase II sirven de receptores para péptidos procesados. Sin embargo, estos péptidos se derivan predominantemente de proteínas de membrana y extracelulares y se presentan a linfocitos T CD4+. La región HLA-D contiene varios genes de clase II y tiene tres subregiones principales: HLA-DR, -DQ y -DP. Tanto las regiones HLA-DQ como -DP contienen un gen funcional para cada una de sus cadenas a y º. La subregión HLA-DR contiene un gen funcional para la cadena a; el número de genes funcionales para la cadena º varía de uno a dos según el haplotipo (Andersson y col., 1987; Apple y Erlich, 1996) .

Actualmente se usan una variedad de técnicas para detectar polimorfismo de HLA, que incluyen procedimientos serológicos, bioquímicos, de reconocimiento de linfocitos T y, más recientemente, de biología molecular.

La serología sigue siendo el procedimiento pilar para el tipado de HLA -especialmente para la clase I -para muchos laboratorios de histocompatibilidad rutinaria. El ensayo de micro-linfocitotoxicidad (Kissmeyer y col., 1969; Terasaki y McClelland, 1964) es el enfoque convencional: células mononucleares de sangre periférica viables (clase I) o linfocitos T separados (clase II) se mezclan con antisueros (policlonales o monoclonales) de especificidad por HLA conocida.

La detección del polimorfismo puede lograrse considerando la diferente composición de aminoácidos de moléculas de HLA por técnicas bioquímicas tales como isoelectroenfoque unidimensional (IEF; Yang, 1987) . Este procedimiento se basa en sustituciones de aminoácidos que contribuyen a cambios en la carga de la molécula de HLA.

Otro procedimiento de tipado de HLA es la reacción de linfocitos mixtos (MLR) . Simultáneamente a observaciones que se hacen usando antisueros específicos para HLA, se observó que los linfocitos de dos fuentes sin relacionar proliferaban cuando se mezclaban en cultivo (Hirschorn y col., 1963) .

El análisis de especificidades por HLA de ADN proporcionó un nuevo enfoque para definir sus diferencias polimórficas. En vez de considerar diferencias en la molécula expresada, el polimorfismo se caracteriza al nivel de nucleótidos.

Un desarrollo importante y poderoso en el campo de la molecular biología ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Mullis y col., 1986; Mullis y Faloona, 1987) . En tipado de tejido, la PCR se usa para amplificar las regiones polimórficas de genes HLA. Este producto de PCR de HLA puede luego analizarse para sus diferencias polimórficas, para establecer el tipo de tejido. Se han desarrollado varios de tales enfoques, que incluyen análisis de heterodúplex de productos de PCR (Clay y col., 1994) , análisis de polimorfismos conformacionales monocatenarios del producto de PCR (PCR-SSCP; Yoshida y col., 1992) , tipado basado en secuencias (SBT; Santamaria y col., 1992 y 1993) , el uso de cebadores específicos para secuencia en la reacción de PCR (PCR-SSP; Olerup y Zetterquist, 1991) , el uso de PCR en combinación con sondaje de oligonucleótidos específicos para secuencia (PCR-SSOP; Saiki y col., 1986) o sondaje por transferencia puntual inversa (Saiki y col., 1989) . Estos enfoques, usados individualmente o en combinación, se han aplicado todos como procedimientos basados en ADN para el tipado de tejido de especificidades por HLA de clase I y clase II. Por ejemplo, Mach y Tiercy (1991) desvelan un procedimiento para el tipado de HLA-DR (clase II) amplificando los alelos diana con cebadores adecuados y determinando los alelos con un panel de sondas específicas para alelo.

Para alelos de clase I, las regiones hipervariables se encuentran en diferentes grados en tanto el exón 2 como el exón 3, que codifican el surco de unión a péptido de la molécula de clase I. El polimorfismo dentro de la clase II está contenido principalmente dentro de regiones hipervariables definidas en el exón 2. Estos polimorfismos hacen diferenciación entre alelos que pueden conseguirse por hibridación con sondas relevantes.

Objetivos de la invención

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para el tipado de los alelos HLA-DRB1*0820, HLA-DRB1*04new y/o HLA-DRB4*01new; comprendiendo dicho procedimiento una etapa de amplificación, como se 5 enumera en las reivindicaciones.

También es un objetivo de la presente divulgación proporcionar cebadores para dicha etapa de amplificación.

También es un objetivo de la presente divulgación proporcionar sondas para dicha etapa de hibridación.

También es un objetivo de la presente divulgación proporcionar un kit de diagnóstico que permita dicho procedimiento para el tipado.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar los fragmentos de proteínas codificados por lo genes HLADRB1*0820, HLA-DRB1*04new y/o HLA-DRB4*01new.

Descripción detallada de la invención

La presente invención desvela la secuencia del exón 2 del alelo de HLA DRB1*0820. Esta secuencia se identifica por SEC ID Nº 1 y se muestra a continuación.

La secuencia se muestra de 5' a 3' y va del codón 5 al codón 94 del exón 2. Se indica la numeración de los codones. Las posiciones de nucleótidos se indican entre paréntesis. Esta secuencia ha sido presentada a la base de datos EMBL y se le asignó el número de acceso AJ000927. El alelo DRB1*0820 es un alelo novedoso que no se ha descrito previamente.

La presente invención también desvela la secuencia del exón 2 del alelo de HLA DRB1*04new. Esta secuencia se identifica por SEC ID Nº 50 y se muestra a continuación.

La secuencia se muestra de 5' a 3' y va del codón 6 al codón 87 del exón 2. Se indica la numeración de los codones. Las posiciones de nucleótidos se indican entre paréntesis. Esta secuencia ha sido presentada a la base de datos EMBL y se le asignó el número de acceso AJ133492. El alelo DRB1*04new es un alelo novedoso que no se ha descrito previamente.

La presente invención también desvela la secuencia del exón 2 del alelo de HLA DRB4*01new. Esta secuencia se identifica por SEC ID Nº 67 y se muestra a continuación.

La secuencia se muestra de 5' a 3' y va del codón 5 al codón 95 del exón 2. Se indica la numeración de los codones.

Las posiciones de nucleótidos se indican entre paréntesis. Esta secuencia ha sido presentada a la base de datos EMBL y se le asignó el número de acceso AJ131789. El alelo DRB4*01new es un alelo novedoso que no se ha descrito previamente.

Teniendo conocimiento de esta información de secuencias, el experto podrá idear procedimientos que permitan el tipado de dicho alelo. Por tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para el tipado de los alelos HLA15 DRB1*0820, HLA-DRB1*04new y/o HLA-DRB4*01new en una muestra; comprendiendo dicho procedimiento:

i) amplificar un fragmento que comprende... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para el tipado de los alelos HLA-DRB1 *0820, HLA-DRB1*04new y/o HLA-DRB4*01new en una muestra, definiéndose el exón 2 de dichos alelos por SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 50 y SEC ID Nº 67, respectivamente; en el que dicho procedimiento comprende:

i) amplificar un fragmento que comprende todo o parte del exón 2 de dicho alelo usando al menos un par adecuado de cebadores;

ii) determinar la ausencia o presencia de los alelos HLA-DRB1*0820, HLA-DRB1*04new y/o HLADRB4*01new en la muestra.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la presencia o ausencia de los alelos se determina por el uso de un conjunto de sondas, hibridándose las sondas de dicho conjunto específicamente con regiones diana que comprenden uno o más nucleótidos polimórficos en el exón 2 o en el exón 3 de dichos alelos.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado adicionalmente porque dichos nucleótidos polimórficos tienen las siguientes posiciones en SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 67:

9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 33, 35, 44, 61, 64, 65, 67, 69, 71, 75, 76, 78, 81, 84, 89, 92, 95, 96, 97, 99, 100, 104, 106, 127, 136, 146, 156, 157, 158, 160, 161, 162, 165, 166, 186, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 203, 205, 207, 208, 209, 217, 218, 219, 220, 221, 237, 239, 241, 244, 245, 251 y 257; y

las siguiente posiciones en SEC ID Nº 50:

5, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 29, 31, 40, 57, 60, 61, 63, 65, 67, 71, 72, 74, 77, 80, 85, 88, 91, 92, 93, 95, 96, 100, 102, 123, 132, 142, 152, 153, 154, 156, 157, 158, 161, 162, 182, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 199, 201, 203, 204, 205, 213, 214, 215, 216, 217, 233, 235, 237, 240, 241, 247, 253.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado adicionalmente porque dichos cebadores se eligen de SEC ID Nº 3 a 12, SEC ID Nº 52 a 54 y SEC ID Nº 107.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado adicionalmente porque dichas sondas se eligen de:

SEC ID Nº 13 a 21 para el tipado de HLA-DRB1*0820;

SEC ID Nº 55 a 61 para el tipado de HLA-DRB1*04new; y/o

SEC ID Nº 62 a 66 para el tipado de HLA-DRB4*01new.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que las sondas se inmovilizan sobre un soporte sólido.

7. Uso de un ácido polinucleico aislado que consiste en el gen HLA-DRB1*0820 y que comprende la secuencia que consiste en el exón 2 del alelo HLA-DRB1*0820 definido por SEC ID Nº 1, o cualquier fragmento de SEC ID Nº 1 que consiste en 10 a 25 nucleótidos, como un cebador o como una sonda para el tipado de dicho alelo.

8. Uso de un ácido polinucleico aislado que consiste en el gen HLA-DRB1*04new y que comprende la secuencia que consiste en el exón 2 del alelo HLA-DRB1*04new definido por SEC ID Nº 50, o un ácido polinucleico aislado que consiste en el gen HLA-DRB4*01new y que comprende la secuencia que consiste en el exón 2 del alelo HLADRB4*01new definido por SEC ID Nº 67, o cualquier fragmento de SEC ID Nº 50 o SEC ID Nº 67 que consiste en al menos 10 nucleótidos, como un cebador o como una sonda para el tipado de dicho alelo.

9. Uso de al menos un cebador y/o una sonda como se define en la reivindicación 7 o la reivindicación 8 para la fabricación de un kit de diagnóstico para el tipado de los alelos HLA-DRB1*0820, HLA-DRB1*04new y/o HLADRB4*01new.

10. Un fragmento de proteína como se define por SEC ID Nº 2, codificado por SEC ID Nº 1, y/o un fragmento de proteína como se define por SEC ID Nº 51, codificado por SEC ID Nº 50.