Un ratón con un gen activado, que comprende un polinucleótido que codifica un C5aR humanizado,

en donde el exón endógeno 3 del locus C5aR de ratón ha sido reemplazado por una secuencia correspondiente que codifica un C5aR humano

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a mamíferos no humanos transgénicos que comprenden un polinucleótido que codifica un C5aR humano o humanizado. La invención también se refiere al uso de los mamíferos no humanos transgénicos en métodos de cribado de agonistas, agonistas inversos y antagonistas del C5aR humano y para analizar la eficacia de agonistas, agonistas inversos y antagonistas del C5aR en diversos modelos de enfermedad en animales.

FUNDAMENTO DE LA INVENCIÓN

La proteólisis de cada una de las proteínas del complemento C3-C5 da lugar a fragmentos catiónicos aminoterminales con moléculas de señalización denominadas anafilatoxinas. La más potente de estas, la C5a, provoca las respuestas más amplias. Considerando los componentes de la respuesta inflamatoria como marginación e infiltración de leucocitos, liberación de enzimas proteolíticas unidas a gránulos, producción de radicales activados derivados de de oxígeno y nitrógeno, cambios en el flujo sanguíneo y fugas por capilares, junto con la capacidad para contraer la musculatura lisa, la molécula C5a es el mediador pro-inflamatorio "completo". A niveles sub-nanomolares a nanomolares, la molécula C5a provoca quimiotaxis de todos los linajes mieloides (neutrófilos, eosinófilos y basófilos, macrófagos y monocitos), y causa permeabilidad vascular que está potenciada marcadamente por las prostaglandinas y los leucocitos circulantes. Las concentraciones nanomolares superiores provocan la desgranulación y activación de la NADPH-oxidasa. Esta amplitud de bioactividad contrasta con otros mediadores inflamatorios. La C5a ha sido implicada en la patogénesis de artritis reumatoide, psoriasis, septicemia, lesión por repercusión y síndrome de dificultad respiratoria en adultos.

Las actividades de la C5a están mediadas por la unión de la C5a a su receptor (C5aR). El C5aR pertenece a la familia de siete receptores transmembranales acoplados a la proteína G. El C5aR es un receptor de alta afinidad para la C5a, con un Kd de ~1 nM, y está situado en varios tipos diferentes de células incluyendo los leucocitos. El número de receptores por célula es extremadamente alto, hasta 200.000 sitios por leucocito. La activación biológica del receptor ocurre en todo el intervalo que satura la unión.

El C5aR comprende un dominio extracelular N-terminal extendido. Este dominio N-terminal grande es típico de los receptores acoplados a la proteína G que se unen a péptidos incluyendo las familias de receptores de la IL-8 y fMet-Leu-Phe (FMLP). La estructura del C5aR se ajusta a la familia de los siete receptores transmembranales, estando seguido el término N extracelular por siete hélices transmembranales conectadas por dominios interhelicoidales que alternan como bucles intracelulares y extracelulares y terminan con un dominio intracelular C-terminal.

Los agonistas del C5aR son útiles para fines terapéuticos, por ejemplo, en defensa contra infecciones bacterianas para estimular los efectos inmunorreguladores de la C5a, y para tratar cánceres, enfermedades de inmunodeficiencia e infecciones graves.

Los antagonistas del C5aR también son agentes terapéuticos útiles, por ejemplo, para tratar enfermedades inflamatorias y trastornos autoinmunitarios. Por ejemplo, los antagonistas del C5aR son útiles en el tratamiento de asma, bronquitis alérgica, inflamación crónica, lupus eritematoso sistémico, vasculitis, artritis reumatoide, osteoartritis, gota, algunas enfermedades autoalérgicas, rechazo de trasplantes, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, colitis ulcerosa), en ciertos estados de choque, infarto de miocardio y encefalopatías pos-virales. Para este fin, se han descrito previamente antagonistas del péptido C5aR y anticuerpos anti-receptor de la C5a. Por ejemplo, el documento WO95/00164 describe anticuerpos dirigidos contra un péptido N-terminal (residuos 9-29) del receptor de la C5a.

Actualmente, son deseables agonistas y antagonistas del C5aR alternativos y/o mejorados, puesto que son métodos mejorados de cribados para agonistas y antagonistas del C5aR.

Se conocen en la técnica métodos de cribado in vitro para la detección de agonistas/antagonistas del C5aR. Por ejemplo, se pueden usar ensayos de quimiotaxis para determinar la capacidad de un anticuerpo o su fragmento funcional de bloquear la unión de un ligando al C5aR y/o inhibir la función asociada con la unión del ligando al receptor. Estos ensayos están basados en la migración funcional de células in vitro inducida por un compuesto. La quimiotaxis se puede determinar por un medio adecuado, tal como en un ensayo que utiliza una placa de quimiotaxis de 96 pocillos o que usa otros métodos reconocidos en la técnica para determinar la quimiotaxis. Por ejemplo, el uso de un ensayo de quimiotaxis transendotelial in vitro está descrito por Springer et al., (Springer et al., documento WO 94/20142, publicado el 15 de septiembre de 1994; véase también Berman et al., Immunol. Invest. 17: 625-677 (1988)). También se ha descrito la migración a través del endotelio en geles de colágeno (Kavanaugh et al., J. Immunol., 146: 4149-4156 (1991)).

MUKHERJEE P. ET AL: JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY, 2000, vol. 105, nº. 2, páginas 124-130, y MUKHERJEE P. ET AL: ABSTRACTS OF THE SOCIETY FOR NEUROSCIENCE, SOCIETY FOR NEUROSCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 26, nº 1/02, 4 November 2000, página 859.14, describen ratones con el gen C5aR desactivado.

GERARD N. P. ET AL: BIOCHEMISTRY, 1993, vol. 32, 1993, páginas 1243-1250, informan de la caracterización detallada del C5aR humano. Las construcciones recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica un C5aR humano y sus deleciones progresivas se transfectaron en diferentes cultivos de células de mamíferos humanos y no humanos, que expresan o no un C5aR endógeno, y proporcionan un sistema modelo in vitro para análisis del funcionamiento del gen del receptor de la C5a humana.

SUMICHIKA H: CURRENT OPINION IN INVESTIGATIONAL DRUGS, 2004, vol. 5, nº. 5, páginas 505-510, describe el cribado farmacéutico de antagonistas del receptor C5aR humano para el tratamiento de inflamación usando un método de ensayo de unión a la C5a humana en membranas de neutrófilos humanos (es decir, in vitro). Se expone la selectividad para especies de los ligandos del C5aR.

Un requisito crítico en el proceso de descubrimiento de fármacos es la demonstración en modelos relevantes en animales que los nuevos agentes terapéuticos identificados por métodos de cribado in vitro sean seguros y eficaces. Además, frecuentemente es deseable comparar la eficacia in vivo de numerosos agentes para seleccionar las propiedades deseables incluyendo las propiedades farmacocinéticas, la eficacia en afectar al resultado de la enfermedad y la falta de efectos secundarios adversos. Uno de los principales obstáculos para el desarrollo de fármacos es pasar los fármacos candidatos desde los ensayos in vitro a la demonstración de la eficacia in vivo. Frecuentemente esto se debe a que muchos fármacos candidatos son específicos de especies. Por ejemplo, un antagonista desarrollado para un receptor quimioatrayente humano, tal como el C5aR, podría antagonizar solamente al C5aR humano y no al C5aR de ratón, conejos o incluso primates superiores. La incapacidad de muchos fármacos candidatos de "trabajar" a través de especies es una razón principal para el desgaste en la fase preclínica.

Por tanto, son deseables métodos mejorados de cribado que permitan la identificación y/o el análisis de agonistas, agonistas inversos y antagonistas del C5aR humano en un ambiente in vivo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han encontrado que cierto número de antagonistas del C5aR reaccionan con el C5aR humano, pero no lo hacen con el C5aR de otras especies. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales MAb 7F3, MAb 6C12 y MAb 12D4 (descritos en la solicitud de patente PCT/AU03/00084) se unen al C5aR humano pero no se unen al C5aR de ratón o babuino. Esto implica la necesidad de un sistema de cribado y validación in vivo que sea capaz de detectar y/o validar agonistas/antagonistas que sean específicos para el C5aR humano.

Los autores de la presente invención también han encontrado que la quimiotaxis de células de múridos manipuladas por ingeniería genética para expresar el C5aR humano es inhibida por anticuerpos anti-C5aR humano. Este hallazgo, asociado con el conocimiento de que la C5a de múridos se une al C5aR humano con alta afinidad,... [Seguir leyendo]

1. Un ratón con un gen activado, que comprende un polinucleótido que codifica un C5aR humanizado, en donde el exón endógeno 3 del locus C5aR de ratón ha sido reemplazado por una secuencia correspondiente que codifica un C5aR humano.

2. Un ratón con un gen activado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el exón endógeno 3 del locus C5aR de ratón ha sido reemplazado por medio de una recombinación homóloga dirigida a la diana por la secuencia correspondiente que codifica el C5aR humano.

3. Un ratón con un gen activado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende una secuencia como la mostrada en la SEQ ID NO: 3 o una de sus variantes alélicas.

4. Un ratón con un gen activado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el polinucleótido comprende una secuencia como la mostrada en la SEQ ID NO:2 o una de sus variantes alélicas.

5. Una (o varias) célula(s) aislada(s), una línea celular, un tejido o u órgano obtenidos del ratón con un gen activado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo la(s) célula(s) asilada(s), la línea celular, el tejido o el órgano un polinucleótido que codifica un C5aR humanizado.

6. Un método para producir un ratón con un gen activado para analizar compuestos para un efecto sobre un fenotipo asociado con la señalización del C5aR, que comprende reemplazar el exón endógeno 3 del locus C5aR de ratón por una secuencia correspondiente que codifica el C5aR humano.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el exón endógeno 3 del locus C5aR de ratón es reemplazad por medio de una recombinación homóloga dirigida a la diana por la secuencia correspondiente que codifica el C5aR humano.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde una construcción polinucleotídica del genoma de ratón con un gen activado con un exón 3 reemplazado codifica un polipéptido que comprende una secuencia como la mostrada en la SEQ ID NO:3 o una de sus variantes alélicas.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde una construcción polinucleotídica del genoma de ratón con un gen activado con un exón 3 reemplazado comprende una secuencia como la mostrada en la SEQ ID NO:2 o una de sus variantes alélicas.

10.Un método para evaluar al menos un efecto farmacocinético y/o farmacodinámico de un compuesto candidato, que comprende administrar un compuesto candidato a un ratón con un gen activado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o a un tejido o células aislados del mismo, y examinar al menos un efecto farmacocinético y/o farmacodinámico del compuesto candidato en el ratón con un gen activado.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde al menos uno de los efectos farmacocinéticos examinados es volumen de distribución, depuración total, unión a proteínas, unión a tejidos, depuración metabólica, depuración renal, depuración hepática, depuración bilial, absorción intestinal, biodisponibilidad, biodisponibilidad relativa, depuración intrínseca, tiempo medio de permanencia, tasa máxima de rnetabolismo, constante de Michaelis-Menten, coeficientes de reparto entre tejidos y sangre o plasma, fracción excretada inalterada en orina, fracción de fármaco convertido sistemáticamente en metabolitos, constante de la velocidad de eliminación, semi-vida o depuración de la secreción.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde al menos uno de los efectos farmacodinámicos es la modulación de un fenotipo asociado con la señalización de C5aR.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende (i) administrar un compuesto candidato a un ratón con un gen activado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4

o a un tejido o a células aislados obtenidos del mismo en condiciones en las que se exprese al menos un fenotipo asociado con la señalización de C5aR; y (ii) monitorizar el desarrollo de al menos un fenotipo después de la administración del compuesto.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además: (iii) comparar la extensión del fenotipo en el ratón con un gen activado o en las células derivadas del mismo, al cual se administró el compuesto, con la de un mamífero o células derivadas del mismo de control, en donde una diferencia en la naturaleza o extensión del fenotipo cuando se compara con el mamífero de control indica el potencial del compuesto para modular la actividad del C5aR.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende: (i) administrar un compuesto candidato a un ratón con un gen activado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un tejido o a células aislados obtenidos del mismo en condiciones en las se exprese que al menos un fenotipo asociado con la señalización del

C5aR; (ii) monitorizar el desarrollo de al menos uno de los fenotipos después de la administración del compuesto; y opcionalmente (iii) comparar la extensión del fenotipo en el ratón con un gen activado, al cual se administró el compuesto, con la de un mamífero de control, en donde una reducción o inhibición en la naturaleza o extensión del fenotipo cuando se compara con el mamífero de control indica el potencial del compuesto para inhibir o reducir la activi

5 dad del C5aR.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende: (i) administrar un compuesto candidato a un ratón con un gen activado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o a un tejido o a células aislados obtenidos del mismo, en condiciones en las que se exprese al menos un fenotipo asociado con la señalización del C5aR; (ii) monitorizar el desarrollo de al menos uno de los fenotipos después de la administración del compuesto; y opcionalmente (iii) comparar la extensión del fenotipo en el ratón con un gen activado, al cual se administró el compuesto, con la de un mamífero de control, en donde una potenciación en la naturaleza o extensión del fenotipo cuando se compara con el mamífero de control indica el potencial del compuesto para promover o potenciar la actividad del C5aR.

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: un péptido, incluyendo un péptido derivado del C5aR o de la C5a u otro péptido no C5aR y capaz de inhibir, reducir o reprimir una función del C5aR y un mutante dominante-negativo del C5aR; un inhibidor no peptídico del C5aR; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al C5aR e inhibe una función del C5aR; una molécula orgánica pequeña, un ácido nucleico que codifica dicho péptido derivado del C5aR o de la C5a u otro inhibidor peptídico que no es C5aR, un ácido nucleico antisentido dirigido contra el mRNA que codifica el C5aR, una ribozima anti-C5aR y un pequeño RNA de interferencia (RNAi) que tiene como diana la expresión del gen C5aR.