ISÓMERO POSICIONAL DE PEG DE UN ANTICUERPO ANTI-TNFalfa (CDP870).

Isómero posicional de PEG de un anticuerpo anti-TNFalfa (CDP870). La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud internacional nº de serie PCT/US 30/08608, presentada el 20 de marzo, 2003, y bajo el Título 35, Código de EEUU §119, de la solicitud provisional de EEUU nº de serie 60/383.765, presentada el 28 de mayo, 2002, que se incorporan como referencia en su totalidad como si estuvieran escritas en la presente. Campo de la invención La presente descripción se refiere a isómeros posicionales de PEG de proteínas recombinantes. De modo más específico, se refiere a los isómeros posicionales de PEG de un anticuerpo que tiene especificidad por los determinantes antigénicos del factor de necrosis tumoral-alfa (TNF) humano. De modo más específico, se refiere a los isómeros posicionales de PEG de CDP870. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden los isómeros posicionales de PEG y a los usos terapéuticos del anticuerpo. Antecedentes de la invención En una molécula de anticuerpo existen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada y cada cadena ligera tienen, en su extremo N-terminal, un dominio variable. Cada dominio variable está compuesto por cuatro regiones de marco (FR) que alternan con tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Los restos en los dominios variables se numeran, de modo convencional, según un sistema concebido por Kabat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EEUU (en lo sucesivo Kabat et al. (supra)). Este sistema de numeración se emplea en la presente memoria descriptiva, excepto cuando se indique lo contrario. Las denominaciones de restos de Kabat no siempre se corresponde directamente con la numeración lineal de los restos aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o más aminoácidos que la numeración de Kabat estricta, que se corresponden con un acortamiento de un componente estructural o con una inserción en un componente estructural, tanto un marco como una CDR, de la estructura básica del dominio variable. La numeración de Kabat correcta de los restos puede determinarse para un anticuerpo concreto mediante el alineamiento de los restos de homología en la secuencia del anticuerpo, con una secuencia numerada según Kabat patrón. Las CDR del dominio variable de cadena pesada se localizan en los restos 31-335 (CDRH1), los restos 50-65 (CDRH2), y los restos 95-102 (CDRH3), según la numeración de Kabat. Las CDR del dominio variable de cadena ligera se localizan en los restos 24-34 (CDRL1), los restos 50-65 (CDRL2), y los restos 89-97 (CDRL3), según la numeración de Kabat. La construcción de anticuerpos con CDR injertadas se describe en la solicitud de patente europea EP-A-0239400, que describe un proceso en el que las CDR de un anticuerpo monoclonal de ratón se injertan en las regiones de marco de los dominios variables de una inmunoglobulina humana mediante mutagénesis dirigida específica de sitio utilizando oligonucleótidos largos. Las CDR determinan la especificidad de unión al antígeno de los anticuerpos, y son secuencias peptídicas relativamente cortas portadas por las regiones de marco de los dominios variables. El primer trabajo sobre la humanización de anticuerpos monoclonales mediante injertos de CDR se realizó con anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos sintéticos, tales como NP. Sin embargo, se han descrito ejemplos en los que un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce a la lisozima, y un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce un antígeno sobre células T humanas se han humanizado mediante injertos de CDR en Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) y Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente. Riechmann et al. descubrieron que la transferencia sólo de CDR (según se define en Kabat (Kabat et al. (supra)), y Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970) no es suficiente para proporcionar una actividad de unión al antígeno satisfactoria en el producto con CDR injertadas. Se descubrió que debe alterarse una serie de restos del marco para que se correspondan con los de la región de marco donante. Los criterios propuestos para seleccionar los restos del marco que es necesario alterar se describen en la solicitud de patente internacional WO 90/07861. Se han publicado una serie de informes que analizan los anticuerpos con CDR injertadas, que incluye Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). El TNF es una citoquina proinflamatoria que es liberada por las células del sistema inmunológica e interacciona con éstas. Por tanto, el TNF es liberado por macrófagos que han sido activados por lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gram-negativas. Como tal, el TNF parece ser un mediador endógeno de importancia capital implicado en el desarrollo y la patogénesis del choque endotóxico asociado con la sepsis bacteriana. También se ha demostrado que el TNF está sobrerregulado en una serie de enfermedades humanas, que incluyen enfermedades crónicas, 2 E03731385 28-10-2011   tales como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la esclerosis múltiple. Ratones transgénicos para la TNF humana producen altos niveles de TNF constitutivamente, y desarrollan una poliartritis espontánea y destructiva que se parece a la artritis reumatoide (Kaffer et al., EMBO J., 10, 4025-4031, 1991). Por tanto, el TNF se denomina una citoquina proinflamatoria. También se han descrito anticuerpos monoclonales contra el TNF en la técnica anterior. Meager et al. (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) describen anticuerpos monoclonales murinos contra TNF recombinante. Fendly et al. (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) describen el uso de anticuerpos monoclonales murinos contra TNF recombinante para la definición de epitopos neutralizantes sobre el TNF. Shimamoto et al. (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) describen el uso de anticuerpos monoclonales murinos contra TNF7 y su uso para prevenir el choque endotóxico en ratones. Además, en la solicitud de patente internacional WO 92/11383, se describen anticuerpos recombinantes, que incluyen anticuerpos con CDR injertadas, específicos para el TNF. Rankin et al. (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) describen el uso de dichos anticuerpos con CDR injertadas para el tratamiento de la artritis reumatoide. El documento US-A-5.919.452 describe anticuerpos quiméricos anti-TNF y su uso para tratar patologías asociadas con la presencia de 5 TNF. Se han propuesto anticuerpos contra el TNF para la profilaxis y el tratamiento del choque endotóxico (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer et al. (Critical Care Medicine, 21, S441-S336, 1993), y Wherry et al. (Critical Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) analizan el potencial terapéutico de anticuerpos anti-TNF para el tratamiento del choque séptico. El uso de los anticuerpos anti-TNF para el tratamiento del choque séptico también es analizado por Kirschenbaum et al. (Critical Care Medicine, 26, 1625-1628, 1998). La artritis inducida por colágeno también puede tratarse de modo eficaz utilizando un anticuerpo monoclonal anti-TNF (Williams et al., PNAS-USA, 89, 9784- 9788, 1992). Se encuentran niveles mayores de TNF en el fluido sinovial y en la sangre periférica de pacientes que padecen artritis reumatoide. Cuando se administran agentes bloqueantes del TNF a pacientes que padecen artritis reumatoide, los agentes reducen la inflamación, mejoran los síntomas, y retrasan los daños en las articulaciones (McKown et al., Arthritis Reum., 42, 1204-1208, 1999). El uso de anticuerpos anti-TNF para el tratamiento de la artritis reumatoide y de la enfermedad de Crohn se analiza en Feldman et al. (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al. (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997), y en Feldman et al. (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Los anticuerpos contra TNF utilizados en estos tratamientos son, en general, anticuerpos quiméricos, tales como los descritos en el documento US-A-5919452. En la actualidad se ha autorizado la comercialización de dos productos bloqueantes del TNF para el tratamiento de la artritis reumatoide. El primero, denominado etanercept, es comercializado por Immunex Corporation como Enbrel. Es una proteína de fusión recombinante que comprende dos dominios del receptor de TNF soluble p75 unidos a la porción Fc de una inmunoglobulina humana. El segundo, denominado infliximab, es comercializado por Centocor Corporation como Remicade. Es un anticuerpo quimérico que tiene dominios variables anti-TNF murinos y dominios constantes de IgG I humanos. Las moléculas de anticuerpos anti-TNF recombinantes de la técnica anterior en general tienen una afinidad reducida por el TNF comparado con los anticuerpos a partir de los cuales... [Seguir leyendo]

1.- Una molécula de anticuerpo aislada que es un fragmento Fab modificado, cuyas secuencias de aminoácidos de la cadena ligera (SEQ ID NO:1) y de la cadena pesada (SEQ ID NO:2) son como se indica en la figura 2, en la que un resto polietilenglicol (PEG) está unido a Cys 214 de la cadena ligera. 2.- La molécula de anticuerpo aislada de la reivindicación 1, que comprende además un enlace disulfuro entre Cys 221 y Cys 227 de la cadena pesada. 3.- Una composición terapéutica o de diagnóstico que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de anticuerpo aislada de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 14 E03731385 28-10-2011   E03731385 28-10-2011   16 E03731385 28-10-2011