Procedimiento de identificación de un compuesto que inhibe o estimula una función de una proteína,

codificada por el ADN que se selecciona de entre el grupo siguiente: (i) un ADN constituido por una secuencia de bases representada por la SEC ID nº 1 del listado de secuencias o una cadena complementaria del mismo; (ii) un ADN que presenta una homología de por lo menos 70% con la secuencia de bases del ADN de (i) y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial de membrana celular, o una cadena complementaria del mismo; (iii) un ADN que comprende una secuencia de bases del ADN de (i) pero del que se han eliminado o sustituido uno a cien nucleótidos, o al que se le han añadido uno a cien nucleótidos, y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial de membrana, o una cadena complementaria del mismo; y (iv) un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con el ADN de (i) y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial de membrana celular, o una cadena complementaria del mismo; que comprende la inducción de la función de la proteína por el ligando de dicha proteína que es: (1) la forma sulfatada del octapéptido de colecistoquinina de la SEC ID nº 14 (CCK-8S), o (2) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de CCK-8S pero uno de cuyos aminoácidos se ha sustituido con un aminoácido homólogo excepto un residuo sulfatado de tirosina en la séptima posición del extremo C del péptido, y que presenta una función que induce un aumento de una concentración de calcio intracelular o un cambio en un potencial de membrana celular en una célula que expresa el ADN, y en el que el procedimiento comprende utilizar por lo menos un elemento de entre el grupo constituido por ADN, un vector recombinante que contiene el ADN, un transformante que se introdujo con el vector recombinante, la línea celular HA-ph0120710-6 depositada con el número de registro FERM BP-10101, una proteína codificada por el ADN, y un anticuerpo que reconoce inmunológicamente dicha proteína; y, determinar si el compuesto de prueba inhibe o estimula la función de dicha proteína inducida por dicho ligando, en el que dicha función de dicha proteína es una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o en el que dicha función de dicha proteína es una función que genera un cambio en un potencial de membrana

Campo técnico

La presente invención utiliza un gen que codifica un receptor acoplado a la proteína G y el producto génico del mismo. Más específicamente, la presente invención utiliza un gen que codifica un receptor acoplado a la proteína G para el que la forma sulfatada del octapéptido de colecistoquinina (a la que, en adelante, se hace referencia como “CCK-8S”) actúa como un ligando, y el producto génico del mismo. Todavía más específicamente, la presente invención utiliza un ADN que codifica una proteína con la función de receptor acoplado a la proteína G o la cadena complementaria de la misma, un ADN que comprende una secuencia parcial de bases del ADN, un vector recombinante que contiene el ADN anterior o la cadena complementaria del mismo, y un transformante con el vector recombinante allí introducido. La invención utiliza asimismo una proteína con la función de receptor acoplado a la proteína G, y un anticuerpo frente a la proteína. La invención se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto que inhibe o estimula una función de la proteína. La invención se refiere además a un procedimiento para identificar un agonista de la proteína anterior. Una enfermedad atribuible a un descenso en el nivel de CCK-8S y/o un descenso en su función puede ser por ejemplo la demencia (que comprende la enfermedad de Alzheimer), los trastornos de ansiedad, la obesidad y la diabetes. Una enfermedad relacionada con la angiogénesis puede ser, por ejemplo, el infarto cerebral, la contusión cerebral o la enfermedad tumoral.

Antecedentes de la técnica

El documento JP 2003/284573 da a conocer secuencias de aminoácidos similares a la secuencia de aminoácidos definida en la secuencia SEC ID nº 2 de la presente invención.

El documento JP 11/032766 y Shiratsuchi T. et al. (1997) -Cytogen3et Cell Genet., vol. 79, págs. 103-108-describen la clonación del gen receptor BAI2 y de variantes de corte y empalme del mismo.

El documento EP 1 270 724 A2 da a conocer procedimientos para identificar ligandos, agonistas y antagonistas para el BAI2 humano. El documento EP 1 270 724 A2 se refiere asimismo a la entrada de una base de datos con el número de registro ADC86417 que describe una proteína BAI2 del GPCR humana codificante de nucleótidos (SEC ID nº 870) similar a la secuencia SEC ID nº 1 de la presente invención.

Kee Hae Jin et. al. (2002) -Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, vol. 22, nº 9, págs. 1054-1067-dan a conocer la secuencia de aminoácidos del receptor BAI2 humano y múrido y las isoformas de corte y empalme del mismo.

La entrada de la base de datos con el número de registro ABP81929 da a conocer una secuencia de aminoácidos de BAIP2 y las secuencias de nucleótidos codificantes.

El receptor acoplado a la proteína G (al que, en adelante, se hace referencia como “GPCR”) es un receptor de luz, olor y sabor, y, al mismo tiempo, es receptor de neurotransmisor y hormona y actúa como importante sensor de células en los organismos vivos, desde las levaduras hasta los seres humanos.

El GPCR es una glicoproteína que está presente en la membrana celular, que es un tipo de receptor de transmembrana de siete dominios con la característica estructural que consiste en presentar siete dominios de membrana celular, constituyendo una superfamilia con muchos miembros. Ya se han identificado mil genes GPCR o más y se están efectuando estudios relativos a la estructura tridimensional de GPCR, los estimuladores extracelulares (a los que en adelante se hace referencia como “ligando”, refiriéndose este término a una sustancia con la capacidad de unirse a un receptor) de GPCR, los sistemas intracelulares de transducción de señales mediante GPCR, y las funciones del mismo y similares.

Cuando un GPCR recibe un estímulo de un ligando, se une a una proteína G presente dentro de la célula. La proteína G es una proteína que se acopla al GPCR y que presenta una función como factor de transducción de señales en la célula. La proteína G se clasifica ampliamente en varios tipos de familias según las funciones relacionadas con diversos factores (en adelante, denominadas “efectoras”) implicados en la transducción de señales en los sistemas intracelulares de transducción de señales y la diferencia de los genes que codifican la proteína. Las proteínas G pertenecientes a cada familia son trímeros que comprenden tres subunidades denominadas α, β y γ, y la guanosina 5'-difosfato (GDP) suele estar unida específicamente a la subunidad α. La proteína G unida a la GDP es una forma inactiva que no muestra acción alguna con respecto al efector. Cuando el GPCR es estimulado por un ligando, tiene lugar una reacción de intercambio entre la GDP unida a la proteína G y la guanosina 5'-trifosfato (GTP) presente en la célula, mediante la cual se libera la GDP de la proteína G y, a continuación, la proteína G se une a la GTP para formar una proteína G unida a GTP. Se hace referencia a la proteína G unida a GTP como forma activa, y rápidamente se disocia en una subunidad α unida a GTP (αGTP) y un dímero (βγ) que comprende las subunidades β-y γ. αGTP y βγ actúan directamente en un efector (por ejemplo, un canal iónico de calcio o un canal iónico de potasio) para activar el sistema intracelular de transducción de señales, induciendo, como resultado, diversas respuestas fisiológicas.

Entre la superfamilia de GPCR, el inhibidor 2 de la angiogénesis de cerebro humano (en adelante, abreviado con las siglas hBAI2) se clasifica en la clase B (de tipo secretina) y su gen está registrado en el sistema GenBank con el número de registro AB 005298.

Aunque existe un informe (bibliografía 1 no relacionada con patentes) que se refiere a la información de las secuencias y la distribución de la expresión de hBAI2, no se han descrito ni la función de hBAI2 ni su participación en enfermedades. Sin embargo, según una comparación estructural con BAI1, homólogo de BAI2, se considera que el dominio de trombospondina de tipo I (en adelante, denominado “dominio TSP-I") está presente en el dominio extracelular (bibliografía 2 no relacionada con patentes). El dominio TSP-I es un dominio característico reconocido en una región que comprende la secuencia de aminoácidos desde la posición 385 hasta la posición 522 en la trombospondina, y es conocido que participa en la matriz extracelular de la trombospondina y como importante dominio funcional en la capacidad de inhibición de la angiogénesis.

Con respecto al hBAI1, se ha documentado que su expresión se encuentra especialmente elevada en el cerebro humano, que un dominio con habilidad inhibidora de la angiogénesis está presente en la región extracelular y que existe la posibilidad de que su expresión esté sujeta al control por parte de p53 y similares, lo que sugiere la posibilidad de que este gen participe de alguna manera en algún mecanismo relacionado con la angiogénesis en el cerebro (bibliografías 1 a 4 no relacionadas con patentes).

Con respecto al gen de ratón BAI2, relacionado con hBAI2, se ha documentado que se observa una correlación negativa en la cantidad de expresión entre BAI2 y el factor vascular de crecimiento endotelial en el tejido cerebral de un modelo de rata con isquemia cerebral, y se considera que, de forma similar a hBAI1, el BAI2 de ratón podría participar en la angiogénesis. Además, también se ha documentado la existencia de una variante de corte y empalme del mismo (especie de ARN producida por el corte y empalme del ARNm) (bibliografía 3 no relacionada con patentes).

Aunque a partir de la información de la secuencia se puede predecir que tanto hBAI1 como hBAI2 pertenecen a la familia del GPCR, no se ha encontrado ningún documento que mencione su funcionamiento como GPCR, ni información relativa a ligandos.

Es conocido que la colecistoquinina (en adelante, abreviada con las siglas “CCK”) es una hormona gastrointestinal que libera la célula endocrina en la membrana mucosa duodenal. La CCK se secreta con la ingesta de grasas, y favorece la contracción de la vesícula biliar y la secreción de la enzima pancreática. Presenta actividad en los órganos digestivos, como la contracción de la vesícula biliar, la estimulación de la secreción de enzima pancreática y el estímulo del movimiento intestinal. La CCK también se considera una sustancia de señalización que transmite la sensación de saciedad a las neuronas cerebrales.

La CCK es... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de identificación de un compuesto que inhibe o estimula una función de una proteína, codificada por el ADN que se selecciona de entre el grupo siguiente:

(i) un ADN constituido por una secuencia de bases representada por la SEC ID nº 1 del listado de secuencias o una cadena complementaria del mismo;

(ii) un ADN que presenta una homología de por lo menos 70% con la secuencia de bases del ADN de (i) y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial de membrana celular, o una cadena complementaria del mismo;

(iii) un ADN que comprende una secuencia de bases del ADN de (i) pero del que se han eliminado o sustituido uno a cien nucleótidos, o al que se le han añadido uno a cien nucleótidos, y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial de membrana, o una cadena complementaria del mismo; y

(iv) un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con el ADN de (i) y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial de membrana celular, o una cadena complementaria del mismo;

que comprende la inducción de la función de la proteína por el ligando de dicha proteína que es:

(1) la forma sulfatada del octapéptido de colecistoquinina de la SEC ID nº 14 (CCK-8S), o

(2) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de CCK-8S pero uno de cuyos aminoácidos se ha sustituido con un aminoácido homólogo excepto un residuo sulfatado de tirosina en la séptima posición del extremo C del péptido, y que presenta una función que induce un aumento de una concentración de calcio intracelular o un cambio en un potencial de membrana celular en una célula que expresa el ADN,

y en el que el procedimiento comprende utilizar por lo menos un elemento de entre el grupo constituido por ADN, un vector recombinante que contiene el ADN, un transformante que se introdujo con el vector recombinante, la línea celular HA-ph01207#10-6 depositada con el número de registro FERM BP-10101, una proteína codificada por el ADN, y un anticuerpo que reconoce inmunológicamente dicha proteína;

y, determinar si el compuesto de prueba inhibe o estimula la función de dicha proteína inducida por dicho ligando, en el que dicha función de dicha proteína es una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o en el que dicha función de dicha proteína es una función que genera un cambio en un potencial de membrana.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende

(a) permitir que dicho transformante o dicha línea celular y un compuesto de prueba coexistan en condiciones que permitan la interacción del transformante o la línea celular con el compuesto de prueba,

(b) introducir un sistema que mide dicha función de dicha proteína que se expresa en una membrana celular del transformante o la línea celular, y

(c) determinar si el compuesto de prueba inhibe o estimula, o no, la función de la proteína mediante la detección de la existencia o no existencia de, o una modificación en, la función de la proteína.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha función de dicha proteína es una función que aumenta una concentración de calcio intracelular y en el que el procedimiento comprende

(a) permitir que dicho transformante o dicha línea celular y un compuesto de prueba coexistan en condiciones que permitan la interacción del transformante o la línea celular con el compuesto de prueba,

(b) medir una concentración de calcio intracelular del transformante o la línea celular, y

(c) determinar si el compuesto de prueba inhibe o estimula, o no, la función de la proteína mediante la detección de un cambio en la concentración de calcio intracelular del transformante o la línea celular.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha función de dicha proteína es una función que genera un cambio en un potencial de membrana y en el que el procedimiento comprende

(a) permitir que dicho transformante o dicha línea celular y un compuesto de prueba coexistan en unas condiciones que permitan la interacción del transformante o la línea celular con el compuesto de prueba, promotor 5,

promotor PGK, GAP pro del transformante o la línea celular, y

(b) medir un potencial de membrana del transformante o la línea celular, y

(c) determinar si el compuesto de prueba inhibe o estimula, o no, la función de la proteína mediante la detección de un cambio en el potencial de membrana del transformante o la línea celular.

5. Procedimiento de identificación de un compuesto que inhibe o estimula la unión de una proteína, codificada por el ADN que se selecciona de entre el grupo siguiente:

(i) un ADN constituido por una secuencia de bases representada por la SEC ID nº 1 del listado de secuencias o una cadena complementaria del mismo;

(ii) un ADN que presenta una homología de por lo menos 70% con la secuencia de bases del ADN de (i) y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial de membrana celular, o una cadena complementaria del mismo;

(iii) un ADN que comprende una secuencia de bases del ADN de (i) pero del que se han eliminado o sustituido uno a cien nucleótidos, o al que se han añadido uno a cien nucleótidos, y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial celular de membrana, o una cadena complementaria del mismo; y

(iv) un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con el ADN de (i) y que codifica una proteína que presenta una función que aumenta una concentración de calcio intracelular o una función que genera un cambio en un potencial de membrana celular, o una cadena complementaria del mismo;

a un ligando de dicha proteína en el que el ligando es:

(1) una forma sulfatada del octapéptido de colecistoquinina de la SEC ID nº 14, o

(2) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de CCK-8S pero uno de cuyos aminoácidos es sustituido con un aminoácido homólogo a excepción de un residuo sulfatado de tirosina en la séptima posición del extremo C del péptido, y que presenta una función que induce un aumento de una concentración de calcio intracelular o un cambio en un potencial de membrana celular en una célula que expresa el ADN;

y en el que dicha proteína y dicho ligando de la proteína se someten a reacción en presencia o ausencia del compuesto para medir la unión entre la proteína y el ligando.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la proteína se expresa en una célula que contiene ADN que codifica la proteína o en un transformante como la línea celular HA-ph01207#10-6 depositada con el número de registro FERM BP-10101.

7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la unión se mide mediante la medición de un cambio en el potencial de membrana celular o un cambio en la concentración de calcio intracelular causada por dicho ligando en presencia y ausencia del compuesto.