EXPRESIÓN HÍBRIDA Y EN TANDEM DE PROTEÍNAS DE NEISSERIA.
Una proteína híbrida que tiene la fórmula: en la que cada L es una secuencia de aminoácidos de engarce opcional,
A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional (i) X1 es (a) la secuencia de aminoácidos de N. meningitidis 936 (SEQ ID 2884 del documento WO99/57280) (b) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de (a); y (ii) X2 es (a) la secuencia de aminoácidos de N.meningitidis 741 (SEQ ID 2536 del documento WO99/57280) (b) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de (a) con una supresión N- terminal hasta e incluyendo el resto 26; o (c) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de (a) o (b)
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2002/003904.
Solicitante: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS S.R.L..
Nacionalidad solicitante: Italia.
Dirección: VIA FIORENTINA 1 53100 SIENA (SI) ITALIA.
Inventor/es: PIZZA,MariagraziaChiron S.p.A.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 6 de Septiembre de 2002.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/22 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Neisseriaceae (F), p. ej. Acinetobacter.
Clasificación PCT:
- C07K14/22 C07K 14/00 […] › de Neisseriaceae (F), p. ej. Acinetobacter.
Clasificación antigua:
- C07K14/22 C07K 14/00 […] › de Neisseriaceae (F), p. ej. Acinetobacter.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
PDF original: ES-2357503_T3.pdf
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Fragmento de la descripción:
Todos los documentos citados en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad.
CAMPO TÉCNICO
Esta invención está en el campo de la expresión de proteínas. En particular, se refiere a la expresión de proteínas de Neisseria (por ejemplo, N. gonorrhoeae o, preferiblemente, N. meningitidis).
TÉCNICA ANTECEDENTE
Las referencias 1 y 2 describen planteamientos alternativos y mejorados para la expresión de proteínas de Neisseria desveladas en las referencias 3 a 6. Uno de tales procedimientos es para producir proteínas híbridas en las que dos o más proteínas de Neisseria se expresan como una única cadena polipeptídica. Este planteamiento ofrece dos ventajas. Primero, una proteína que puede ser inestable o escasamente expresada sobre sí mismo se puede asistir mediante la adición de una pareja híbrida adecuada que vence el problema. Segundo, la fabricación comercial se simplifica ya que solamente se necesita emplear una expresión y purificación con el fin de producir dos proteínas útiles separadamente.
Es un objeto de la presente invención proporcionar además planteamientos alternativos y mejorados para la expresión de proteínas de Neisseria.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una proteína híbrida que tiene la fórmula:
NH2–A–[–X–L–]nB–COOH En la que L es una secuencia de aminoácidos de engarce opcional, A es una secuencia de aminoácidos N–terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C– terminal opcional, y n = 2,
(i) X1 es
(a) la secuencia de aminoácidos de N. meningitidis 936 (SEQ ID 2884 del documento WO99/57280)
(b) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de (a); y
(ii) X2 es
(a) la secuencia de aminoácidos de N. meningitidis 741 (SEQ ID 2536 del documento WO99/57280)
(b) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de (a) con una supresión N– terminal hasta e incluyendo el resto 26 de la secuencia de aminoácidos of (a); o
**(Ver fórmula)**
**(Ver fórmula)**
(c) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más identidad de secuencia con la 10 secuencia de aminoácidos de (a) o (b).
Proteínas híbridas
De este modo la invención proporciona un procedimiento para la expresión simultánea de dos proteínas de Neisseria, en el que dichas dos o más proteínas están unidas de manera que se traducen como una única cadena de polipéptido. En general, las proteínas híbridas de la invención se pueden representar por la fórmula: NH2–A–[–X–L–]n–B–COOH en la que X es una secuencia de aminoácidos, L es una secuencia de aminoácidos de engarce opcional, A es una secuencia de aminoácidos N–terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C- terminal opcional, y n = 2.
Los restos -X-
Los 2 restos -X-son 741, y ; o
(b) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de (a) Si un resto -X tiene una secuencia de péptidos guía en su forma de tipo salvaje, esta se puede incluir u omitir en las proteínas híbridas descritas en la forma de longitud completa, está preferiblemente en el extremo C–terminal y una proteína híbrida; se va a usar en el extremo N, si se prefiere usar una forma AG de 741.
Los restos -L-
Para cada uno de los n ejemplos de [–X–L–], la secuencia de aminoácidos de engarce L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n = 2 el híbrido puede ser NH2-X1-L1X2-L2- COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2 COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc.
La (s) secuencia (s) de aminoácidos (s) de engarce -L-típicamente será corta (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos es decir, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias de péptidos cortas que facilitan clonación, engarces de poliglicina (es decir, GIYn donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y etiquetas histidina (es decir, His" donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos de engarce adecuados serán evidentes para los expertos en la técnica Un engarce útil es GSGGGG (SEQ ID 27), formándose el dipéptido Gly-Ser a partir de un sitio de restricción BamHI, ayudando de este modo a la clonación y manipulación, y siendo el terapéptido GlY4 un engarce típico de poli-glicina.
Si Xn+1 es una proteína ∆G y Ln es un engarce glicina, esto puede ser equivalente a Xn+1, no siendo una proteína ∆G y estando Ln ausente.
El resto-A-
- A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal. Esta típicamente será corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos es decir, 35 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias guía para dirigir el tráfico de proteínas, o secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, etiquetas histidina es decir, Hisn, donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos N-terminal adecuadas serán evidentes para los expertos en la técnica. Si X1 carece de su propio extremo N metionina, -A- puede ser un resto de metionina.
El resto -B-
- B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Esta típicamente será corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 45 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden etiquetas histidina es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), o secuencias que potencian la estabilidad de la proteína. Otras secuencias de aminoácidos C-terminal adecuadas serán apreciadas por los expertos en la técnica
Formas polimórficas de proteínas
La invención puede usar secuencias de aminoácidos de cualesquiera cepas de N. meningitidis. Referencias a una proteína particular incluyen por tanto la proteína de cualquier cepa. Las variaciones de secuencia entre cepas se incluyen dentro de (b)
Las secuencias de r eferencia del serogrupo B de N. meningitidis incluyen:
El listado de secuencias en el presente documento incluye formas polimórficas de proteínas 741 (SEO ID 1 - 22) y que se han identificado:
Serogrupos y cepas
Las proteínas preferidas de la invención comprenden restos -X- que tienen una secuencia de aminoácidos encontrada en el serogrupo B de N. meningitidis. Dentro de una única proteína de la invención, los restos -X- individuales pueden ser de una o más cepas. Por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que X1 o de una cepa diferente.
Dentro del serogrupo B, los restos de -X- preferidos son de las cepas 2996, MC58, 95N477, o 394/98. La cepa 95N477 algunas veces se denomina en el presente documento como 'ET-37', siendo ésta su tipo electroforético. La cepa 394/98 algunas veces se denomina en el presente documento como 'nz', ya que es una cepa de Nueva Zelanda.
741 es preferiblemente de las cepas del serogrupo B MC58, 2996, 394/98, o 95N477,
o de la cepa del serogrupo C 90/18311.
Las cepas se indican como un subíndice por ejemplo, 741MCS8 es proteína 741 de la cepa MC58. Salvo que se establezca de otra manera, las proteínas mencionadas en el presente documento (por ejemplo, sin subíndice) son de la cepa 2996 de N. meningitidis, que se puede tomar como una cepa 'referencia'. Sin embargo, se apreciará, que la invención no se limita en general a la cepa. Como se ha mencionado anteriormente, las referencias generales a una proteína se pueden tomar para incluir una proteína de cualquier cepa. Esto típicamente tendrá identidad de secuencia a 2996 de 90% o más (por ejemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más).
Secuencias.
La invención también proporciona una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEO ID 1 a 22. También proporciona proteínas y ácido nucleico que tienen identidad de secuencia a éstas. Como se ha descrito anteriormente, el grado de 'identidad de
secuencia' es mayor que 90%,
La invención proporciona... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Una proteína híbrida que tiene la fórmula:
**(Ver fórmula)**
5 en la que cada L es una secuencia de aminoácidos de engarce opcional, A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional
(i) X1 es
(a) la secuencia de aminoácidos de N. meningitidis 936 (SEQ ID 2884 del documento WO99/57280)
(b) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de (a); y
**(Ver fórmula)**
(ii) X2 es 15 (a) la secuencia de aminoácidos de N.meningitidis 741 (SEQ ID 2536 del documento
**(Ver fórmula)**
(b) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de (a) con una supresión N- terminal hasta e incluyendo el resto 26; o (c) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de (a) o (b).
2. La proteína híbrida de la reivindicación 1, en la que X1 es 936 de la cepa 2996, y
(a) tiene la secuencia
(b) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de (a).
**(Ver fórmula)**
3. La proteína híbrida de la reivindicación 1, en la que X2
(a) tiene una secuencia seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID números 1 -22 en el presente documento; o
(b) una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de (a).
4. La proteína híbrida of una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en la que L tiene 20 o menos aminoácidos.
5. La proteína híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la que L es un engarce de poliglicina.
6. La proteína híbrida of una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en la que L tiene la secuencia de aminoácidos GSGGGG.
7. La proteína híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en la que A tiene 40 o menos aminoácidos.
8. La proteína híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en la que B tiene 40 o menos aminoácidos.
9. La proteína híbrida de la reivindicación 1, que tiene la secuencia relatada en la SEQ ID 30.
10. Ácido nucleico que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9.
11. Una composición que comprende la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y una o más de las siguientes proteínas:
(1) proteína de Neisseria 287
(2) proteína de Neisseria 741
(3) proteína de Neisseria ORF46.1
(4) proteína de Neisseria 961
(5) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, en la que n = 2, X1 = proteína de Neisseria 287, X2 = proteína de Neisseria 953 (6) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, en la que n = 2, X1 = proteína de Neisseria 287, X2 = proteína de Neisseria 919
(7) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, en la que n = 2, X1 = proteína de Neisseria 287, X2 = proteína de Neisseria 961
(8) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, en la que n = 2, X1 = proteína de Neisseria 287, X2 = proteína de Neisseria 741.
12. La composición de la reivindicación 11, que comprende las proteínas (4) y (5).
13. La composición de la reivindicación 12, en la que proteína (4) comprende la SEQ ID 31 y la proteína (5) comprende la SEQ ID 28 o la SEQ ID 29.
14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende además:
- una proteína antígeno de N. meningitidis;
- una preparación de vesículas de membrana externa (OMV) de N. meningitidis;
- un antígeno de sacárido de N. meningitidis;
- un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae;
- un antígeno de virus de hepatitis A, B o C;
- un antígeno de Bordetella pertussis;
- un antígeno de difteria;
- un antígeno de tétanos;
- un antígeno de proteína de Helicobacter pylori;
- un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae;
- un antígeno de N. gonorrhoeae;
- un antígeno de Chlamydia pneumoniae;
- un antígeno de Chlamydia trachomatis;
- un antígeno de Porphyromonas gingivalis;
- antígeno (s) de polio;
- antígeno (s) de rabia;
- antígenos de sarampión, paperas y / o rubéola;
- antígeno (s) de influenza;
- un antígeno de Moraxella catarrhalis;
- un antígeno de Streptococcus agalactiae;
- un antígeno de Streptococcus pyogenes; y / o
- un antígeno de Staphylococcus aureus.
15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. La composición de la reivindicación 15 para uso como un medicamento.
17. Uso de una composición de la reivindicación 15 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad provocada por Neisseria.
18. La composición de la reivindicación 15 para uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por Neisseria.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 17 o la composición de acuerdo con la reivindicación 18, en la que dicha enfermedad es meningitis bacteriana.
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