CONTROL DE EXPRESIÓN USANDO SECUENCIAS INTERGÉNICAS VARIABLES.

Control de expresión usando secuencias intergénicas variables Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de producción de anticuerpos en los que las cadenas pesadas y ligeras de una molécula de anticuerpo concreto se codifican por el DNA presente en un mensaje dicistrónico en el que los dos cistrones están enlazados por una secuencia intergénica optimizada. Antecedentes de la invención ES 2 365 540 T3 La capacidad de los anticuerpos para reconocer antígenos específicos los ha hecho herramientas muy útiles y eficaces en medicina y biotecnología. Se han usado anticuerpos específicos para antígenos en tipos seleccionados de célula para dirigir estos anticuerpos a la célula seleccionada. Se ha descubierto que el enlace de anticuerpos a receptores en células afecta en algunos casos a la función de la célula. También se han conjugado a anticuerpos agentes terapéuticos y de diagnóstico para dirigir específicamente estos agentes a células seleccionadas. Esta técnica se ha usado particularmente en células cancerosas como objetivo. También se han usado anticuerpos para dirigirlos a antígenos en células infectadas vírica y bacteriológicamente, tales como el TNF, o para usarlos en ensayos. En biotecnología los anticuerpos tienen muchos usos, tales como sondas, en purificación y en catálisis. Las moléculas de anticuerpos consisten globalmente en cuatro cadenas polipeptídicas - dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Cada cadena comprende dominios tanto variables como constantes. Las cadenas ligeras comprenden dos dominios: VL y CL, mientras que las cadenas pesadas comprenden al menos cinco dominios: VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3 y uno opcional CH4. Las cuatro cadenas están siempre organizadas del mismo modo general: las dos cadenas pesadas están enlazadas conjuntamente por al menos un enlace disulfuro y cada cadena pesada está también enlazada a una de las cadenas ligeras por un enlace disulfuro de manera que ambas cadenas ligeras están enlazadas a una cadena pesada diferente. Las moléculas de anticuerpos tienen aproximadamente forma de Y y consisten fundamentalmente en dos partes funcionales principales. La primera parte funcional es responsable del reconocimiento de antígenos específicos y está formada por la parte superior de los brazos de la Y. La región de unión al antígeno en cada parte comprende un dominio VH y un dominio VL. Cada dominio variable contiene tres regiones hipervariables que, junto con las tres regiones hipervariables de la otra cadena, forman el sitio de unión al antígeno. Estas regiones hipervariables se conocen como regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3). Las CDRs, que forman lazos, están soportadas sobre regiones de armazón. Debido a su variabilidad entre anticuerpos, las regiones que comprenden VH y VL se conocen como regiones 'V'. La segunda parte funcional es responsable de desencadenar las funciones efectoras de otras células que dispondrán del antígeno reconocido por el anticuerpo y está formada por las partes inferiores de los brazos y el tallo de la Y. Esta región se conoce como la región constante 'C' debido a su relativa constancia. Comprende los dominios CL y todos los dominios C de las cadenas pesadas. Hay dos tipos de cadena ligera: y , y cinco tipos de cadena pesada: , , , y µ. La clase de anticuerpo está determinada por el tipo de cadena pesada que tiene: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM respectivamente. Los fragmentos de anticuerpo, en los que se ha separado parte de su región constante por escisión enzimática, se usan también en medicina y biotecnología. Estos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Se sabe dirigir la producción de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales (que tienen una especificidad antigénica particular) fusionando una célula de bazo productora de anticuerpos con una célula de mieloma, dando por resultado un hibridoma (Kohler, G. and Milstein, C. Cultivos continuos de células fusionadas secretoras de anticuerpo de especificidad predefinida. Naure, 256, 495-497 (1975)). Sin embargo, tales anticuerpos son inadecuados para usar en terapia humana porque son inmunogénicos en humanos. La mayoría de los anticuerpos monoclonales son producidos por células no humanas. Se han desarrollado técnicas de DNA recombinante que permiten que las propiedades útiles de más de un anticuerpo se combinen para producir un nuevo anticuerpo. La producción de anticuerpos quiméricos, en los que el sitio de unión al antígeno que comprende la región V completa de un anticuerpo se enlaza a la región constante de un anticuerpo diferente, se describe en los documentos EP-A-0120694 (Celltech Limited), EP-A-0125023 (Genentech Inc. and City of Hope), EP-A-0171496 (Research Development Corporation, Japan), EP-A-0173494 (Stanford University) y WO-A-86/01533 (Celltech Limited). El documento WO-A-86/01533, por ejemplo, describe la preparación de un anticuerpo quimérico en el que regiones V de múridos se unen a regiones constantes de humanos. Sin embargo, la gran proporción de residuos en anticuerpos quiméricos no humanos/humanos que se derivan del donante no humano da por resultado la posibilidad de que el anticuerpo provoque una respuesta inmunológica potencialmente perjudicial, en particular si se administra a lo largo de un periodo prolongado (Begent et al., Br. J. Cancer, 62,487 (1990)). 2 ES 2 365 540 T3 "Humanización" de anticuerpos es una técnica que hace que los anticuerpos quiméricos no humanos/humanos se muestren más semejantes a los anticuerpos humanos para el sistema inmune humano y se ha desarrollado en un intento para superar la respuesta inmunológica no deseada mencionada anteriormente. El documento EP-A­ 0239400 (Winter) describe cómo, en vez de usar una región variable completa de múridos, se injertan las CDRs de un anticuerpo monoclonal de múridos en las regiones de armazón de los dominios variables de un anticuerpo humano. Así, son de múridos solo las CDRs que forman el dominio mismo de enlace al antígeno y los otros residuos son humanos. Reichmann et al., ("Remodelación de anticuerpos humanos para terapia", Nature, 332, 323-324, 1988) descubrió que es conveniente convertir otros residuos humanos del dominio variable en sus homólogos del donante no humano para mejorar la actividad de unión al antígeno. Un tal residuo se encontró en la posición 27 de la cadena pesada humana, que, cuando se transformó de serina humana en el correspondiente residuo de rata (fenilalanina) dio por resultado una capacidad mejorada de unión al antígeno. Otro tal residuo se descubrió en la posición 30. Sin embargo, una construcción que contenía un cambio de serina humana a tirosina de rata en la posición 30 de la cadena pesada además del cambio en la posición 27 mencionado anteriormente no tuvo una actividad enlazante significativamente alterada sobre el anticuerpo humanizado con el cambio de serina a fenilalanina en la posición 27 solamente. Los residuos de cadena pesada 27 y 30 están dentro del lazo estructural adyacente a CDR1. Queen et al., (WO 90/07861) conjeturaron que otros residuos que interaccionan con las CDRs son también importantes en la determinación de la afinidad de unión al antígeno. Teniendo esto en cuenta, Queen et al., propusieron cuatro criterios para determinar qué residuos deben proceder del donante y cuáles del aceptor cuando se diseñan anticuerpos humanizados. En un análisis más definitivo, Adair et al., (documento WO 91/09967) revelaron una jerarquía de números de residuos que permitirá diseñar un anticuerpo humanizado. Se han publicado una serie de reseñas que exponen los anticuerpos injertados con CDR, que incluyen Vaughan et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). Se han descrito también conjugados de anticuerpos en los que la región constante se ha fusionado con moléculas efectoras o reporteras que pueden actuar como agentes terapéuticos o de diagnóstico (documentos WO 95/01155, US 3927193, US 4331647, US 4348376, US 4361544, US 468457, US 4444744, US 4460459 y US 4460561 y reseñas por Waldmann, T.A., Science, 252, 1657, (1991); Koppel, G.A., Bioconjug. Chem., 1, 13, (1990); Oeltmann, T.N. and Frankel, A.E., FASEB J., 5, 2334, (1991); y van den Bergh, H.E., Chemistry in Britain, Mayo 1986, 430­ 439). Se sabía producir anticuerpos normales, quiméricos o humanizados transfectando una célula huésped adecuada con dos vectores de expresión, uno que contiene una secuencia de DNA que codifica la cadena pesada y uno que contiene una secuencia de DNA que codifica la cadena ligera del anticuerpo requerido (documento WO-A­ 91/09967). Alternativamente, se sabía transfectar una célula huésped con un vector de expresión que contiene tanto la secuencia de DNA que codifica la cadena pesada como la secuencia de DNA que codifica la cadena ligera del anticuerpo requerido. En el... [Seguir leyendo]

1. Un mensaje dicistrónico para producir una molécula de anticuerpo con una particular especificidad de unión al antígeno, en el que el cistrón anterior contiene DNA que codifica para la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón posterior contiene DNA que codifica para la correspondiente cadena ligera o cadena pesada 5 respectivamente, caracterizado porque los dos cistrones están unidos por una secuencia intergénica optimizada (IGS) donde la IGS es IGS 1 (SEQ ID NO:4), IGS2 (SEQ ID NO:7), IGS3 (SEQ ID NO:10) o IGS4 (SEQ ID NO:13), y donde el anticuerpo producido no es un anticuerpo anti-TNF o un anticuerpo anti-KDR. 2. Un vector de expresión que contiene un mensaje dicistrónico de acuerdo con la reivindicación 1. 3. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2 donde el vector de expresión es pTT0-1 (SEQ ID NO:3). 4. Una célula huésped microbiana que se ha transformado con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2 ó la reivindicación 3. 5. Una célula huésped microbiana de acuerdo con la reivindicación 4, donde la célula huésped es E.coli. 6. Un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 ó la reivindicación 5. 7. Una molécula de anticuerpo producida por el procedimiento de la reivindicación 6. 12 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3 ES 2 365 540 T3