COMPOSICIONES DE UN AISLADO DE PROTEÍNA DE CANOLA.

Una proteína 7S de canola que se aísla y purifica a partir de una masa micelar de proteína de canola.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con los componentes de las proteínas individuales de las composiciones del aislado de proteína de canola.

Antecedentes de la invención

Los aislados de proteína de canola, se pueden fabricar a partir de harina de semillas oleosas de canola. En copending United States Patent Application No. 10/137,391 (US2003/0125526) presentada el 3 de Mayo, 2002, se describe un método para fabricar aislados de proteína de canola a partir de harina de semillas oleosas de canola, tales aislados que tienen al menos un contenido de proteína del 100 % en peso (N x 6.25). El procedimiento involucra un proceso de etapas múltiples que comprende la extracción de harina de semillas oleosas de canola utilizando una solución salina, separación de la resultante solución acuosa de proteína a partir de la harina de semilla oleosa residual, incremento de la concentración de la proteína de la solución acuosa a al menos aproximadamente 200 g/L mientras que conserva la fuerza iónica sustancialmente constante mediante el uso de una técnica de membrana selectiva, dilución de la solución de proteína concentrada resultante en agua fría para provocar la formación de las micelas de proteína, sedimentar las micelas de proteína para formar una masa micelar de proteína (PMM) amorfa, pegajosa, gelatinosa similar al gluten, y recuperación de la masa micelar de proteína a partir del sobrenadante que tiene un contenido de proteína de al menos aproximadamente 100 % en peso, según se determina por nitrógeno de Kjeldahl (N) x 6. 25. Como se utiliza en este documento, el contenido de proteína se determina en base a peso seco. La PMM recuperada se puede secar.

En una modalidad del proceso descrito anteriormente y como se describe específicamente en Application No. 10/137,391 (US2003/0125526), el sobrenadante a partir de la etapa de sedimentación de PMM se procesa para recuperar un aislado de proteína que comprende la proteína seca a partir de la PMM húmeda y el sobrenadante. Este procedimiento se puede llevar a cabo, mediante la concentración inicial del sobrenadante utilizando membranas de ultrafiltración, la mezcla del sobrenadante concentrado con la PMM húmeda y el secado de la mezcla. El aislado de proteína de canola resultante, tiene una pureza alta de al menos aproximadamente 90% en peso de la proteína (N x 6.25), preferiblemente al menos aproximadamente 100% en peso de proteína (N x 6.25).

En otra modalidad del proceso descrito anteriormente y como se describe específicamente en Application No. 10/137,391 (US2003/0125526), el sobrenadante a partir de la etapa de sedimentación de PMM, se procesa para recuperar una proteína a partir del sobrenadante. Este procedimiento se puede llevar a cabo mediante la concentración inicial del sobrenadante utilizando membranas de ultrafiltración y el secado del concentrado. El resultante aislado de proteína de canola tiene una alta pureza de al menos aproximadamente 90% en peso de la proteína (N x 6.25), preferiblemente al menos aproximadamente 100% en peso de la proteína (N x 6.25).

Los procedimientos descritos en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos, mencionadas anteriormente, son esencialmente procedimientos por lotes. En copending United States Patent Application No. 10/298,678 (US2004/0039174), se describe un proceso continuo para fabricar aislados de proteína de canola. En virtud de esta, la harina de semillas oleosas de canola se mezcla continuamente con una solución salina, la mezcla se transporta a través de una tubería mientras que se extrae la proteína a partir de la harina de semillas oleosas de canola para formar una solución acuosa de proteína, la solución acuosa de proteína se separa continuamente de la harina residual de semillas oleosas de canola, la solución acuosa de proteína se transporta continuamente a través de una operación de membrana selectiva para aumentar el contenido de proteína de la solución acuosa de proteína a al menos aproximadamente 200 g/L mientras que conserva la fuerza iónica sustancialmente constante, la solución de proteína concentrada resultante se mezcla continuamente con agua fría para provocar la formación de las micelas de proteína, y las micelas de proteína se dejan decantar continuamente mientras que el sobrenadante se desborda continuamente hasta que la cantidad deseada de PMM se ha acumulado en el recipiente de sedimentación. La PMM se retira del recipiente de sedimentación y se puede secar. La PMM tiene un contenido de proteína de al menos aproximadamente 90% en peso, según se determina por nitrógeno de Kjeldahl (N) x 6.25, preferiblemente al menos aproximadamente 100% en peso (N x 6.25).

Como se describe en la US Patent Application No. 10/137,391 (US2003/0125526), mencionada anteriormente, el sobrenadante desbordado se puede procesar para recuperar el aislado de proteína de canola del mismo.

Se sabe que la semilla de canola contiene cerca de 10 a aproximadamente 30% en peso de las proteínas y varios componentes de proteínas diferentes han sido identificados. Estas proteínas se distinguen mediante los diferentes coeficientes de sedimentación (S). Estas conocidas e identificadas proteínas incluyen una globulina 12S, conocida como cruciferina, y una proteína de almacenamiento 2S, conocida como napina.

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La canola también se conoce como colza o aceite de colza.

Japanese patent application No. H03-201611 (publication No. H05-43597) revela un método de separación de la proteína 7S de soja para obtener la proteína con una pureza de más del 85%, preferiblemente más del 90%, por medio de un proceso de precipitación isoeléctrico. German patent application No. DE10035292 revela un método de extracción de una proteína nativa o recombinante a partir de una planta, en particular la extracción de napina, napina-línea 2S albúmina, cruciferina, globulina 11S similar a la legúmina o un anticuerpo de scFv recombinante, por medio de una extracción preliminar seguida por cromatografía de intercambio iónico.

Raab et al (Die Nahrung 36 (1992) 3, 239-247) han caracterizado siete variedades de colza mediante la investigación de los patrones de proteínas solubles en solución reguladora utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida y cromatografía líquida de alta resolución (cromatografía de exclusión por tamaño y de intercambio catiónico).

Krzyzaniak et al (Die Nahrung 42 (1998) 3/4, 201-204) describe la purificación a homogeneidad de la proteína de almacenamiento albúmina 2S a partir de semillas de colza (napina), y la caracterización de su estructura secundaria y estabilidad conformacional por dicroísmo circular y calorimetría de barrido diferencial de alta sensibilidad.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Además de las proteínas 12S y 2S, hemos encontrado que los procedimientos descritos anteriormente para el aislamiento del aislado de proteína de canola producen cantidades significantes de una proteína 7S, que parece ser una nueva proteína. En consecuencia, en un aspecto de la invención, se proporciona una proteína 7S de canola que se aísla y purifica a partir de una masa micelar de proteína de canola. Preferiblemente, la proteína tiene un peso molecular, según se determina por MALDI-MS, de 145 kDa, preferiblemente compuesta de tres subunidades, cada una con un tamaño aproximado de 413 aminoácidos, que preferiblemente tiene un análisis de aminoácidos sustancialmente como se publica en las siguientes tablas:

TABLA VII (continuación)

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TABLA VIII (continuación)... [Seguir leyendo]

1. Una proteína 7S de canola que se aísla y purifica a partir de una masa micelar de proteína de canola.

2. La proteína de la reivindicación 1, que tiene un peso molecular, según se determina por MALDI-MS, de 145 kDa, preferiblemente compuesta de tres subunidades, cada una con un tamaño aproximado de 413 aminoácidos, que preferiblemente tiene un análisis de aminoácidos sustancialmente como se publica en las siguientes tablas:

TABLA VII TABLA VIII

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3. La proteína reivindicada en la reivindicación 1 o 2, en donde dicha masa micelar de la proteína se forma por la dilución de una solución salina concentrada de la proteína de canola extraída a partir de harina de semillas oleosas de canola, bajo condiciones ligeramente ácidas.

4. Un método de aislamiento y purificación de una proteína de canola 7S a partir de un aislado de proteína de canola que contiene una mezcla de proteínas de canola y que muestra un perfil de proteínas de: 60 a 98 % en peso de proteína 7S, 1 a 15 % en peso de proteína 12S,

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0 a 25 % en peso de proteína 2S, que comprende: proporcionar dicho aislado de proteína de canola que tiene un contenido de proteína de al menos el 90 % en peso en base a peso seco y a una conversión de nitrógeno de Kjeldahl de N X 6.25,

solubilizar el aislado de proteína de canola,

someter la solución de proteína resultante a cromatografía líquida de alta resolución preparativa o a un procedimiento equivalente de separación de proteínas en función de su tamaño molecular, recolectar las fracciones del eluente que contienen la proteína de canola 7S, someter las fracciones seleccionadas a ultrafiltración para reducir el volumen del eluente, dializar el eluente concentrado para retirar el material solubilizante, y secar el dializado para recuperar la proteína de canola 7S.

5. El método reivindicado en la reivindicación 4, en donde dicho aislado de proteína de canola es aquel que muestra un perfil de proteínas que tiene: 88 a 98 % en peso de la proteína 7S,

1 a 10 % en peso de la proteína 12S, y 0 a 6 % en peso de la proteína 2S.

6. El método reivindicado en la reivindicación 4 o 5, en donde dicho aislado de proteína de canola tiene un contenido de proteína de al menos el 100 % en peso.

7. Un método de aislamiento y purificación de una proteína de canola 2S, a partir de un aislado de proteína de canola que contiene una mezcla de proteínas de canola y que muestra un perfil de proteínas que tiene: 60 a 95 % en peso de la proteína 2S, 5 a 40 % en peso de la proteína 7S,

0 a 5 % en peso de la proteína 12S, que comprende: proporcionar dicho aislado de proteína de canola que tiene un contenido de proteína de al menos el 90 % en peso en base a peso seco y a una conversión de nitrógeno de Kjeldahl de N X 6.25,

solubilizar el aislado de proteína de canola,

someter la solución de proteína resultante a cromatografía líquida de alta resolución preparativa o a un procedimiento equivalente de separación de proteínas en función de su tamaño molecular, recolectar las fracciones del eluente que contienen la proteína de canola 2S, someter las fracciones seleccionadas a ultrafiltración para reducir el volumen del eluente, dializar el eluente concentrado para retirar el material solubilizante, y secar el dializado para recuperar la proteína de canola 2S.

**(Ver fórmula)**

8. El método reivindicado en la reivindicación 7, en donde dicho aislado de proteína de canola es aquel que muestra un perfil de proteínas que tiene: 70 a 95 % en peso de la proteína 2S,

5 a 30 % en peso de la proteína 7S, y 0 a 2 % en peso de la proteína 12S.

9. El método reivindicado en la reivindicación 7 u 8, en donde dicho aislado de proteína de canola tiene un contenido de proteína de al menos el 100 % en peso.