Un método para inducir a las células estrómicas de médula ósea a que se diferencien in vitro en células de Schwann derivadas de células estrómicas de médula ósea,

que comprende las etapas de: (1) cultivar células estrómicas de médula ósea obtenidas de médula ósea en un medio de cultivo esencial estándar suplementado con un suero; (2) añadir un agente reductor a dicho medio de cultivo, y cultivar posteriormente dichas células; (3) añadir ácido retinoico a dicho medio de cultivo, y cultivar posteriormente dichas células; y (4) añadir a dicho medio de cultivo forskolina y un factor estimulante de la diferenciación, supervivencia y crecimiento, que actúa sobre nervios y neurogliocitos, y cultivar posteriormente dichas células para obtener dichas células de Schwann derivadas de células estrómicas de médula ósea.

Células de Schwann derivadas de células estrómicas de médula ósea

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método in vitro para inducir la diferenciación de células estrómicas de médula ósea en células de Schwann, a células de Schwann derivadas de células estrómicas de médula ósea, a una composición farmacéutica para la regeneración neuronal que las comprende, y a un método para el tratamiento de enfermedades neuronales usando las células de Schwann y la composición.

Antecedentes de la técnica Se cree que el daño al sistema nervioso, y particularmente al sistema nervioso central, incluyendo cerebro, médula espinal, y nervio óptico, es irreversible, conduciendo finalmente al proceso de degeneración. Los accidentes de tráfico y las lesiones deportivas, la isquemia, los tumores, la inflamación prolongada, la enfermedad degenerativa criptógena, y similares, están entre las causas de enfermedades neurológicas que se producen con una elevada incidencia entre la población, y son de importancia social urgente.

La irreversibilidad del daño del sistema central se atribuye al entorno neuroglial del tejido nervioso. El cerebro y la médula espinal tienen el mismo entorno neuroglial, que se describirá ahora usando el nervio óptico como un ejemplo de un nervio central.

1) En primer lugar, las fibras nerviosas sufren degeneración, y desaparecen gradualmente. Durante el proceso, las vainas de mielina que cubren los nervios también se degeneran, dejando restos celulares (véase la Fig. 1b) . Las vainas de mielina formadas por oligodendrocitos contienen sustancias que inhiben fuertemente la regeneración y alargamiento de las fibras nerviosas (1) .

2) Los astrocitos proliferan y se hacen más grandes, dando como resultado gliosis (véase Fig. 1b) . Más específicamente, desplazan las fibras nerviosas, ocupando las localizaciones primarias e inhibiendo de ese modo físicamente la regeneración (2) . Los astrocitos que forman la gliosis presentan una morfología que contrasta considerablemente con la de los astrocitos normales, con un mayor número de procesos y formas intrincadamente complejas. Particularmente en el caso de lesión, el sitio de daño muestra numerosas capas de astrocitos apiladas ortogonalmente a la dirección de extensión de las fibras nerviosas y unidas juntas en sus procesos, que forman una estructura de barrera similar a una caperuza.

3) El procesamiento de los oligodendrocitos y sus sustancias de restos celulares, tales como mielina, después de la degeneración, es más lento en comparación con otros tejidos que se regeneran, tales como sistema nervioso periférico. La razón principal de esto es presumiblemente el grado muy bajo de infiltración de células inmunitarias periféricas, tales como macrófagos y monocitos, dando como resultado el procesamiento retrasado del residuo en las etapas tempranas.

Se han propuesto las siguientes explicaciones para la falta de regeneración de nervios ópticos.

1) Como se menciona anteriormente, los oligodendrocitos tienen un potente efecto inhibidor sobre la regeneración neuronal. Específicamente, se ha demostrado que la molécula Nogo, extraída de oligodendrocitos, es un inhibidor (1, 9) . Los experimentos con sistemas en cultivo han mostrado que, durante la extensión de axones, los procesos que entran en contacto con las vainas de mielina de oligodendrocitos no solo detienen su extensión, sino que incluso retroceden (inhibición de contacto) . Además, los axones no se extienden en áreas mielinizadas, y, en el cultivo, los procesos crecen para evitarlos.

2) Los astrocitos glióticos producen diversas sustancias inhibidoras, incluyendo proteoglucanos tales como sulfato queratina y sulfato de condroitina (3) .

3) Los nervios ópticos y todo el sistema nervioso central son silenciosos en exceso, incluso después de sufrir lesión. El sistema no está bajo vigilancia inmunitaria, y esto se considera en su lugar una desventaja para la regeneración. Por ejemplo, el sistema nervioso periférico descrito aquí más abajo difiere del nervio óptico incluso en la estructura de los neuroglias, y se ha comparado y estudiado como un sistema de regeneración, incluso aunque está compuesto del mismo tejido nervioso. Con la lesión del tejido nervioso periférico, las células inmunitarias, tales como macrófagos periféricos, se infiltran rápidamente (en unas pocas horas hasta un par de días) para procesar el residuo celular. Mientras tanto, se segregan citocinas en grandes cantidades, promoviendo la regeneración del tejido nervioso. Tal regeneración neuronal se produce en concierto con una cascada de fenómenos, conduciendo una reacción a otra, pero no se observa infiltración de macrófagos en el nervio óptico en las etapas tempranas. Esto se ha atribuido a la supresión de la actividad de macrófagos en el sistema nervioso central, incluyendo el nervio óptico (4) . Parece que esta función supresora surgió a fin de evitar la digestión macrofágica de redes neuronales centrales desarrolladas complejas. Por lo tanto, se ha conjeturado que la ausencia del primer desencadenante en los nervios ópticos es la que conduce a la degeneración en lugar de a la regeneración.

4) A fin de que se produzca la regeneración, es necesario un armazón estructural para inducir fibras nerviosas. Sin embargo, una vez que se ha producido la degeneración en los nervios ópticos, se pierde la ruta para la regeneración. En los nervios ópticos, cada oligodendrocito forma numerosas vainas de mielina sobre las fibras nerviosas, y los astrocitos rodean a las fibras mielinizadas y cubren a los haces de fibras no mielinizadas (véase la Fig. 2, parte inferior) . La membrana basal está presente solo fuera de los astrocitos que forman la membrana limitante neuroglial, o en otras palabras, se puede considerar que todo el nervio óptico está dentro de una vaina de membrana basal única. En los nervios periféricos, la membrana basal sirve como una ruta para la regeneración. En consecuencia, una vez que se han degenerado las fibras nerviosas en el nervio óptico, ya no está presente la ruta que una vez existió para cada una de las fibras nerviosas.

Incluso los nervios periféricos, a diferencia de los nervios centrales, son capaces de regenerarse.

A diferencia de los nervios centrales, las células primarias de los nervios periféricos son células se Schwann. Todas las fibras nerviosas, ya estén mielinizadas o no mielinizadas, están cubiertas con células de Schwann (véase Fig. 2, parte superior) . Las células de Schwann derivan de células de la cresta neural, mientras que los neurogliocitos centrales (oligodendrocitos, astrocitos) , que actúan de forma inhibidora sobre la regeneración neuronal, derivan de tubos neurales, y por lo tanto las fuentes de diferenciación son diferentes.

Se cree que los nervios periféricos se regeneran de la siguiente manera.

1) Cuando los nervios periféricos sufren una lesión, tal como un corte, se produce la degeneración walleriana en el extremo periférico del sitio de la lesión (véase la Fig. 3) . Las células de Schwann vuelven a un estado no diferenciado desde el tipo diferenciado formador de mielina, y entonces se activan para dividirse y proliferar, presentando una forma funicular. En los nervios periféricos, las fibras nerviosas individuales están rodeadas independientemente por células de Schwann, con el área externa cubierta por una membrana basal (véase la Fig. 2) . Esto es, cada uno de los nervios reside dentro de una vaina de membrana basal separada. De este modo, incluso cuando se produce la degeneración, las células de Schwann activadas en la vaina de la membrana basal proliferan para formar una estructura funicular, proporcionando así un punto de apoyo para la reconstrucción de la red neural. Por lo tanto, la degeneración walleriana no es una degeneración en el sentido estricto, sino más bien la primera etapa hacia la regeneración.

2) Los macrófagos periféricos desempeñan un papel importante en el proceso de degeneración walleriana. Los macrófagos se infiltran rápidamente en el extremo periférico del sitio de lesión, procesando los restos de las fibras nerviosas degeneradas y la mielina (véase la Fig. 3) , a la vez que también segregan citocinas, tales como IL-1, para activar las células de Schwann. Aunque no se pueden extraer conclusiones definitivas con respecto a la causa que induce la filtración de macrófagos, se han señalado a las propias células de Schwann como un candidato probable. En cualquier caso, se cree que las células... [Seguir leyendo]

1. Un método para inducir a las células estrómicas de médula ósea a que se diferencien in vitro en células de Schwann derivadas de células estrómicas de médula ósea, que comprende las etapas de:

(1) cultivar células estrómicas de médula ósea obtenidas de médula ósea en un medio de cultivo esencial estándar suplementado con un suero;

(2) añadir un agente reductor a dicho medio de cultivo, y cultivar posteriormente dichas células;

(3) añadir ácido retinoico a dicho medio de cultivo, y cultivar posteriormente dichas células; y

(4) añadir a dicho medio de cultivo forskolina y un factor estimulante de la diferenciación, supervivencia y crecimiento, que actúa sobre nervios y neurogliocitos, y cultivar posteriormente dichas células para obtener dichas células de Schwann derivadas de células estrómicas de médula ósea.

2. El método como se define en la reivindicación 1, en el que dicho medio de cultivo esencial estándar es un medio esencial mínimo modificado alfa de Eagle.

3. El método como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicho suero es suero fetal de ternero.

4. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho agente reductor es un reactivo que contiene sulfhidrilo.

5. El método como se define en la reivindicación 4, en el que dicho reactivo que contiene sulfhidrilo es βmercaptoetanol.

6. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de dicho agente reductor está entre 1 nM y 10 mM.

7. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo de cultivo en la etapa (2) está entre 1 hora y 5 días.

8. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de dicho ácido retinoico está entre 0, 001 ng/ml y 1 µg/ml.

9. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo de cultivo en la etapa (3) está dentro de 30 días.

10. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de dicha forskolina está entre 0, 001 ng/ml y 100 µg/ml.

11. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho factor estimulante de la diferenciación y supervivencia de neurogliocitos se selecciona del grupo que consiste en neuregulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA, factor de crecimiento de fibroblastos básico, y sus mezclas.

12. El método como se define en la reivindicación 11, en el que dicha neuregulina es heregulina, un subtipo de la misma.

13. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de dicho factor estimulante de la diferenciación y supervivencia de neurogliocitos está entre 0, 001 ng/ml y 100 µg/ml.

14. El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tiempo de cultivo en la etapa (4) está dentro de 30 días.