CÉLULAS QUE PRESENTAN CARACTERÍSTICAS DE CÉLULAS NEURONALES PROGENITORAS.

Células que presentan características de células neuronales progenitoras [0001] CAMPO DE LA INVENCIÓN [0002] La invención se refiere a procedimientos de preparación de células que presentan características de células neuronales progenitoras procedentes de citoblastos mesenquimales regulando las vías celulares en los citoblastos mesenquimales que están asociados a la transdiferenciación glial de los citoblastos mesenquimales. [0003] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0004] Una limitación en la investigación y tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central (SNC) o sistema nervioso periférico (SNP) es el reconocimiento convencional de que las neuronas terminalmente diferenciadas están significativamente limitadas en su capacidad de proliferar. Por consiguiente, cualquier tratamiento de enfermedades del SNC o SNP que requiera el trasplante de neuronas terminalmente diferenciadas es difícil de conseguir. [0005] Una aproximación propuesta para superar esta dificultad ha sido el cultivo de un gran número de células 20 mitóticas que presentan características de células neuronales progenitoras ("CPCs"). En teoría dichas células se podrían diferenciar in vivo en neuronas que podrían funcionar en el tratamiento de enfermedades del SNC y/o SNP. Alternativamente, las CPCs se podrían diferenciar in vitro en neuronas y a continuación ser trasplantadas a pacientes. No obstante, dichas CPCs son raras y difíciles de aislar de los donantes. Por tanto, convencionalmente, los investigadores han intentado obtener CPCs a partir de citoblastos embrionarios y fetales (denominados 25 colectivamente en lo sucesivo como "citoblastos embrionarios").   [0006] Los citoblastos embrionarios, que son células pluripotentes, se han usado para generar una gran variedad de tipos de tejido, y podrían ser una fuente de CPCs. I. Weissman, Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution (Review). Cell 100, 157-168 (2000). No obstante, el uso de citoblastos embrionarios genera una serie de cuestiones éticas, y así es una fuente no favorecida de citoblastos para la producción de CPCs. Además, los citoblastos embrionarios pueden ser tumorigénicas, que genera problemas de seguridad en cuanto a cualquier procedimiento de trasplante que potencialmente podría dar como resultado la introducción de citoblastos embrionarios a un paciente, como la creación de un injerto de CPC procedente de citoblastos embrionarios. [0007] Algunos investigadores han intentado utilizar otros tipos de citoblastos en la producción de CPCs, tales como citoblastos mesenquimales. La Solicitud de patente de Estados Unidos 20030003090 de Prockop, y col., presentada el 2 de enero de 2003, y titulada "Diferenciación in vitro dirigida de células de médula ósea estromales en células neurales progenitoras" describe que los niveles de expresión tanto de la NSE como de la vimentina se incrementaron en citoblastos mesenquimales humanos después de su incubación con IBMX 0,5 mM y dbcAMP 1 mM. El incremento en los ARNm de la NSE y la vimentina coincidió con la aparición de células neurales en los cultivos. No obstante, Prockop y col., informaron de que no hubo cambio en el nivel de expresión de MAP1B o de TuJ-1. Puesto que la NSE, MAP1B, y TuJ-1 son marcadores tempranos característicos de neuronas, y la vimentina es un marcador temprano de la glía, Prockop y col., han sugerido que los hMSCs se transdiferenciación in vitro en algunos progenitores tempranos de neuronas o de la glía. No obstante, las células progenitoras tempranas de Prockop pueden ser no deseables para su uso debido a que parecen presentar un fenotipo neuronal muy inmaduro cuya eficacia clínica no se comprende bien. El documento WO 03/066856 describe la producción de citoblastos neurales procedentes de citoblastos mesenquimales después de su transfección con el dominio intracelular Notch. Los citoblastos neurales se podrían diferenciar posteriormente en células neurales que expresan MAP-2ab y TuJ-1 después de la inducción del factor trófico. [0008] Por consiguiente, hay escasez de fuentes de CPC disponibles convencionalmente y adecuadas para su uso, por ejemplo, en la investigación y tratamiento de enfermedades del SNC o SNP. Además, hay escasez de procedimientos que se puedan usar para producir dichas CPCs de una manera adecuada conveniente para su uso. Lo que se necesita son procedimientos y composiciones que superen dichos problemas. [0009] RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0010] En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de producción de células que presentan 60 características de células neuronales progenitoras procedentes de material que comprende citoblastos mesenquimales, el procedimiento que comprende: la regulación de las vías celulares en los citoblastos mesenquimales que están asociados a la transdiferenciación glial de los citoblastos mesenquimales; donde las vías celulares están suficientemente reguladas para inducir al menos a una parte de los citoblastos mesenquimales para que se transdiferencien en células que presentan características de células neuronales progenitoras; caracterizado 65 porque la regulación comprende la inhibición de la transducción de las señales JAK/STAT. 2 [0011] En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de células que presentan características de células neuronales progenitoras que comprende: la incubación de citoblastos mesenquimales con un inhibidor de JAK/STAT en una cantidad suficiente para inducir al menos a una parte de los citoblastos mesenquimales para que se transdiferencien en células que presentan características de células neuronales progenitoras; con la condición de que la interacción no comprende la transfección de los citoblastos mesenquimales con el dominio intracelular Notch. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 10 [0012] El inventor ha descubierto de manera inesperada y sorprendente que los problemas y limitaciones indicadas anteriormente se pueden superar poniendo en práctica la invención descrita en el presente documento. La presente invención aborda la producción de CPCs a partir de citoblastos mesenquimales (MSCs) regulando las vías celulares en los hMSCs que están asociadas a la transdiferenciación glial de los hMSCs. En el presente documento se describen formas para realizar y usar la invención. [0013] Para los propósitos de esta invención, las células que presentan características de células neuronales progenitoras ("CPCs") se definen como células que son mitóticas, expresan nestina y otros marcadores celulares específicos para las células neurales progenitoras/precursores neurales, y proceden de MSCs. Las CPCs se pueden diferenciar en neuronas, glía, y oligodendrocitos, y precursores de cualquiera de los anteriores. Las CPCs pueden 20 proceder de los hMSCs según los procedimientos descritos en el presente documento. En una forma de realización, las CPCs humanas son EfnB2+, CD90-, el receptor beta del PDGF. Estos marcadores se pueden usar para separar las CPCs de los hMSCs usando FACS después de la transdiferenciación glial de los hMSCs según la presente invención. Los procedimientos adecuados de manipulación de CPCs son conocidos de manera convencional, incluyendo aquellos procedimientos descritos, por ejemplo, en la Solicitud de patente de Estados Unidos publicada 25 20020012903 de Goldman y col.   [0014] En general, según la invención las CPCs se pueden producir regulando las vías celulares en los hMSCs que están asociadas a la transdiferenciación glial de los hMSCs, estando las vías celulares suficientemente reguladas para inducir al menos a una parte de los hMSCs para que se transdiferencien en CPCs. [0015] Pueden ser útiles una amplia variedad de procedimientos de regulación. Éstos incluyen, pero no están limitados a, la modificación del medio y las condiciones en las que se crecen las células, si se crecen ex vivo; la modificación del entorno del tejido en el que están presentes los hMSCs, si se crecen in vivo; o la incubación de los hMSCs con agentes de regulación gliales. La forma precisa de regulación no importa, mientras la transdiferenciación glial de los hMSCs esté eficazmente regulada, permitiendo así la diferenciación de los hMSCs en CPCs. En general, la regulación de las vías celulares en MSCs que están asociadas a la transdiferenciación glial de los hMSCs tiene lugar en condiciones que son adecuadas para mantener a los MSCs o CPCs en un estado mitótico y viable. Dichas condiciones son conocidas por alguien experto en la materia, y se pueden encontrar en, por ejemplo, M. Kallos y col., Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med Biol Eng Comput. Mayo de 2003; 41 (3):271-82. Condiciones y técnicas adecuadas también se pueden encontrar en cualquier otra parte de la biografía tanto para el cultivo celular como para... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la producción de células que presentan características de células neuronales progenitoras a partir de material que comprende citoblastos mesenquimales, el procedimiento que comprende: la regulación de las vías celulares en los citoblastos mesenquimales que están asociados a la transdiferenciación glial de los citoblastos mesenquimales; donde las vías celulares están suficientemente reguladas para inducir al menos a una parte de los citoblastos mesenquimales para que se transdiferencien en células que presentan características de células neuronales progenitoras; caracterizado porque la regulación comprende la inhibición de la transducción de la señal JAK/STAT y no comprende la transfección de citoblastos mesenquimales con el dominio intracelular Notch. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1, donde la regulación comprende la incubación de un inhibidor de JAK/STAT con citoblastos mesenquimales. 3. Un procedimiento para la producción de células que presentan características de células progenitoras neuronales que comprende: 20 la incubación de citoblastos mesenquimales con un inhibidor de JAK/STAT en una cantidad suficiente para inducir al menos a una parte de los citoblastos mesenquimales para que se transdiferencien en células que presentan características de células neuronales progenitoras; caracterizado porque el procedimiento no comprende la transfección de los citoblastos mesenquimales con el dominio intracelular Notch. 4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde los citoblastos mesenquimales se seleccionan del grupo constituido por citoblastos mesenquimales humanos, citoblastos mesenquimales de rata, citoblastos mesenquimales de ratón, citoblastos mesenquimales de primate, citoblastos mesenquimales de cerdo, citoblastos mesenquimales de vaca, y citoblastos mesenquimales de oveja. 5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde la incubación comprende la transfección del inhibidor de JAK/STAT en los citoblastos mesenquimales. 35 6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde los citoblastos mesenquimales proceden de sangre del cordón umbilical.   7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde los citoblastos mesenquimales proceden de médula ósea. 8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde el inhibidor de JAK/STAT se selecciona entre: ARNi para el silenciamiento de genes de la vía de JAK/STAT; oligonucleótidos de sentido contrario para la regulación por disminución de la vía de JAK/STAT; inhibidores de STAT1 y STAT3; la molécula pequeña inhibidora de la JAK, 4-(4'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina. 12