Anticuerpos de IP-10 y sus usos.

Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo,

en donde el anticuerpo se une específicamente a IP-10 humano y no reacciona de forma cruzada con MIG humano y no reacciona de forma cruzada con ITAC humano.

Anticuerpos de IP-10 y sus usos Antecedentes de la invención La proteína inducible por Interferón gamma 10 (IP-10) (también conocida como CXCL10) es una quimiocina de 10kDa que se identificó originalmente basándose en la expresión del gen IP-10 en células tratadas con Interferón gamma (IFN-gamma) (Luster, A.D. y col. (1985) Nature 315:672-676) . IP-10 muestra homología con proteínas que tienen actividad quimiotáctica, talescomo factor de plaquetas 4 y beta-tromboglobulina, y con proteínas que tienen actividad mitogénica, tales como péptido activador de tejido conectivo III (Luster, A.D. y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2868-2871) . IP-10 se secreta por diversas células, incluyendo células endoteliales, monocitos, fibroblastos y queratinocitos, en respuesta a IFN-gamma (Luster, A.D. y Ravetch, J.V. (1987) J. Exp. Med. 166:10841097) . También se ha mostrado que IP-10 está presente en macrófagos dérmicos y células endoteliales en respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en piel humana (Kaplan, G. y col. (1987) J. Exp. Med. 166:1098-1108) . Aunque originalmente se identificó basándose en su inducción por IFN-gamma, IP-10 también puede inducirse por IFN-alfa, por ejemplo en células dendríticas (Padovan, B. y col. (2002) J. Leukoc. Biol. 71:669676) . La expresión de IP-10 también puede inducirse en células del sistema nervioso central, tales como astrocitos y microglía, por estímulos tales como IFN-gamma, virus y lipopolisacárido (Vanguri, R. y Farber, J.M. (1994) J. Immunol. 152:1411-1418; Ren, L.Q. y col. (1998) Brain Res. Mol. Brain Res. 59:256-263) . La inmunobiología de IP10 se revisa en, L.F y col. (1997) CytokineGrowth Factor Rev. 8:207-219.

El receptor para IP-10 ha sido identificado como CXCR3, un receptor de siete transmembranas (Loetscher, M. y col. (1996) J. Exp. Med. 184:963-969) . CXCR3 ha mostrado que se expresa en linfocitos T activados pero no en linfocitos T en reposos, ni en linfocitos B, monocitos o granulocitos (Loetscher, M. ycol, mencionado anteriormente) . Se ha mostrado que la expresión de CXCR3 se regula positivamente en células NK por estimulación con TGF-beta 1 (Inngjerdingen, M. ycol. (2001) Blood97:367-375) . También se han identificado otros dos ligandos para CXCR3: MIG (Loetscher, M. ycol, mencionado anteriormente) e ITAC (Cole, K.E. ycol. (1998) J. Exp. Med. 187:2009-2021) .

La unión de IP-10 con CXCR3 ha mostrado que media en la movilización de calcio y quimiotaxis en linfocitos T activados (Loetscher, M. ycol., mencionado anteriormente) . La quimiotaxis y movilización de calcio intercelular también se inducen por unión de IP-10 con CXCR3 en células NK activadas (Maghazachi, A.A. ycol. (1997) FASEB

J. 11:765-774) . Dentro del timo, se ha mostrado que IP-10 es un quimioatrayente de linfocitosT TCRß+ CD8+, linfocitos T TCR+ y células de tipo NK (Romagnani, P. ycol. (2001) Blood 97:601-607) .

IP-10 o su receptor CXCR3 ha sido identificado en diferentes afecciones inflamatorias y autoinmunes, incluyendo esclerosis múltiple (véase por ejemplo, Sorensen, T.L. ycol. (1999) J. Clin. Invest. 103:807-815) , artritis reumatoide (véase por ejemplo, Patel, D.D. ycol. (2001) Clin. Immunol. 98:39-45) , colitis ulcerosa (véase, por ejemplo, Uguccioni, M. ycol. (1999) Am. J. Pathol. 155:331-336) , hepatitis (véase, por ejemplo, Narumi, S. ycol. (1997) J. Immunol. 158:5536-5544) , lesión de la médula espinal (véase, por ejemplo, McTigue, D.M. ycol. (1998) J. Neurosci. Res. 53:368-376; Gonzalez ycol. 2003. Exp. Neurol. 184:456-463) , lupus eritematoso sistémico (véase, por ejemplo, Narumi, S. ycol. (2000) Cytokine 12:1561-1565) , rechazo de trasplantes (véase por ejemplo, Zhang, Z. ycol. (2002) J. Immunol, 168:3205-3212) , síndrome de Sjogren (véase, por ejemplo, Ogawa, N. ycol. (2002) Arthritis Rheum. 46:2730-2741) . En consecuencia, son deseables agentes terapéuticos que inhiben la actividad, en particular agentes que son adecuados para su uso en seres humanos.

El documento WO 02/15932 desvela métodos para tratar enfermedades desmielinizantes.

Liu, M. T. et al (2001) J. Immunol. 167: 4091-4097 desvela la neutralización de la quimiocina CXCL10 que reduce la invasión celular inflamatoria y desmielinización y mejora la función neurológica en un modelo viral de esclerosis múltiple.

Carr, D. J. et al (2003) Arvo Annual Meeting Abstract desvela un anticuerpo neutralizador para la quimiocina CXCL10 que reduce la inflamación ocular y retarda la propagación viral después de infección por VHS-1 de la córnea.

Carr, D J et al (2003) J. Virol. 77: 10037-10046 desvela el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-CXCL10 en infección retiniana y queratitis por virus del herpes del tipo 1.

El documento WO 01/09187 desvela anticuerpos monoclonales humanos para Her2/neu.

McKay Brown et al (1996) J. Immunol. 156: 3285-3291 desvela tolerancia a reemplazos de aminoácidos individuales, pero no múltiples, en el anticuerpo V-H CDR2.

Klein, R. S. et al (2004) J. Immunol. 172: 550-559 desvela la inducción independiente del ligando de quimiocina 10 CXC/proteína inducible por IFN 10 de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental.

Sumario de la invención La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales humanos aislados o partes de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a IP-10 humana, y no reaccionan de forma cruzada con MIG humano, o ITAC

humano. Además, los anticuerpos inhiben la unión de IP-10 con su receptor, CXCR3, inhiben el flujo de calcio inducido por IP-10 en células que expresan receptor inhiben la migración de células inducida por IP-10 (quimiotaxis) . Adicionalmente, se ha mostrado que los anticuerpos de la invención se unen a IP-10 en secciones del cerebro de un sujeto humano al que se ha diagnosticado esclerosis múltiple.

En realizaciones preferidas de la invención, la IP-10 humana comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID Nº 121 [Genbank Acc. Nº. NP_001556]; el CXCR3 comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID Nº: 122 [Genbank Acc. Nº. NP_001495]; la IP-10 de mono Rhesus comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID Nº: 123 [Genbank Acc. Nº. AAK95955]; la IP-10 de ratón comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID Nº: 124 [GenbankAcc. Nº. NP_067249]; el IMG comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID Nº: 125 [Genbank Acc. Nº. NP_002407]; y/o el ITAC humano comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID Nº: 126 [Genbank Acc. Nº. NP_005400].

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente con IP-10 y comprende una región variable de cadena pesada que es el producto o deriva de un gen de línea germinal de VH humano seleccionado del grupo que consiste en un gen de VH 3-33 humano, un gen de VH 3-30.3 humano, un gen de VH 5-51 humano y un gen de VH 4-61 humano. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente a IP-10 y comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o deriva de un gen de línea germinal de Vk humano seleccionado del grupo que consiste en un gen de Vk A27 humano, un gen de Vk L15 humano, un gen de Vk L6 humano y un gen de Vk L18 humano. En otra realización más, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo se une específicamente con IP-10 y comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen de línea germinal de VH seleccionado del grupo que consiste en un gen de VH 3-33 humano, un gen de VH 3-30.3 humano, un gen de VH 5-51 humano y un gen de VH 4-61 humano; y

(b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o deriva de un gen de línea germinal de V

humano seleccionado del grupo que consiste en un gen de Vk A27 humano, un gen de Vk L15 humano, un gen de Vk L6 humano y un gen de Vk L18 humano.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que es el producto de o deriva de un gen de VH 3-33 humano; y

(b) una región variable de cadena ligera que es el producto de o deriva de un gen Vk humano seleccionado del grupo que consiste en un gen... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se une específicamente a IP-10 humano y no reacciona de forma cruzada con MIG humano y no reacciona de forma cruzada con ITAC humano.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo de longitud completa de un isotipo IgG1 o IgG4 o es un fragmento de anticuerpo.

3. El anticuerpo o la parte de unión a antígeno de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en donde:

(a) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 32, y la secuencia de CDR3 de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 81;

(b) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 24, y la secuencia de CDR3 de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 73;o

(c) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 28, y la secuencia de CDR3 de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 77.

4. El anticuerpo o la parte de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 9, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 21, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 32, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 59, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 70 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 81;

(b) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 1, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 13, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 24, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 51, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 62 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 73; o

(c) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 5, una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 17, una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 28, una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 55, una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 66 y una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 77.

5. El anticuerpo o la parte de unión a antígeno de las reivindicaciones 1 o 2, que compite por la unión a IP-10 con el anticuerpo de la reivindicación 4 o que se une al mismo epítopo en IP-10 que el anticuerpo de la reivindicación 4.

6. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo o la parte de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 unido con un agente terapéutico tal como una citotoxina o un isótopo radiactivo.

7. Una molécula biespecífica que comprende el anticuerpo o la parte de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, unido con un segundo resto funcional que tiene una especificidad de unión diferente que dichos anticuerpo o parte de unión a antígeno.

8. Una composición que comprende el anticuerpo o la parte de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el inmunoconjugado de la reivindicación 6 o la molécula biespecífica de la reivindicación 7, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o la parte de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico, o una célula hospedadora que comprende dicho vector de expresión.

10. Un ratón transgénico que comprende transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un hibridoma preparado a partir de dicho ratón en donde el hibridoma produce dicho anticuerpo.

11. Un anticuerpo o una parte de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un método para tratar una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria.

12. Un anticuerpo o una parte de unión a antígeno de la reivindicación 11 para uso en un método para tratar de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la enfermedad se selecciona de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn) , lupus eritematoso sistémico, diabetes de Tipo I, trastornos cutáneos inflamatorios (por ejemplo, psoriasis, liquen plano) , enfermedad tiroidea autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto) , síndrome de Sjogren, inflamación pulmonar (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, sarcoidosis pulmonar, alveolitis linfocítica) , rechazo de trasplantes, lesión de la médula espinal, lesión cerebral (por ejemplo, ictus) , enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson) , gingivitis, inflamación inducida por terapia génica, enfermedades de angiogénesis, enfermedad inflamatoria del riñón (por ejemplo, nefropatía de IgA, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis de progresión rápida) y aterosclerosis.

13. Un anticuerpo o una parte de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un método para tratar una infección viral o bacteriana que implica actividad de IP-10 no deseada.

14. Un anticuerpo o una parte de unión a antígeno de la reivindicación 13 para uso en un método para tratar de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la infección viral está mediada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de la hepatitis C (VHC) , virus del herpes simple de tipo I (VHS-1) o el virus del Síndrome Respiratorio Agudo Grave (SARS) .

15. Un método para preparar el anticuerpo o la parte de unión a antígeno como se ha definido en la reivindicación 1, que comprende:

a) proporcionar:

(i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDR1 que se selecciona de SEC ID Nº: 5, 9 y 1, una secuencia de CDR2 que se selecciona de SEC ID Nº: 17, 21 y 13; y una secuencia de CDR3 que se selecciona de SEC ID Nº: 28, 32 y 24; o

(ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDR1 que se selecciona de SEC ID Nº: 55, 59 y 51, una secuencia de CDR2 que se selecciona de SEC ID Nº: 66, 70 y 62 y una secuencia de CDR3 que se selecciona de SEC ID Nº: 77, 81 y 73;

(b) alterar al menos un resto de aminoácido dentro de al menos una secuencia de anticuerpo de región variable, seleccionándose dicha secuencia de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera, para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y

(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.