Método de diferenciación/inducción de células estromales de médula ósea en células nerviosas por transferencia del gen Notch.

Un método para inducir células estromales de médula ósea (BMSC) a diferenciarse en células precursorasneurales in vitro que comprende las etapas de:

(1) aislar BMSC procedentes de médula ósea, y cultivar dichas células en un medio de cultivo esencialnormalizado suplementado con un suero; e

(2) introducir en dichas células, unas secuencias que comprenden un ácido nucleico que codifica un dominiointracelular de Notch, y cultivar adicionalmente dichas células para producir células precursoras neurales.

Método de diferenciación/inducción de células estromales de médula ósea en células nerviosas por transferencia del gen Notch 5

Campo técnico La presente invención se refiere a un método de inducir diferenciación en células estromales de médula ósea para células precursoras neurales o células neurales, y especialmente neuronas dopaminérgicas, mediante la introducción de un gen Notch, y se refiere además a células precursoras neurales obtenidas mediante el método y al uso terapéutico de las células

Antecedente de la técnica La reconstrucción de la función neural en dolencias neurodegenerativas avanzadas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ELA (esclerosis lateral amiotrófica) y similares requiere la sustitución de las células neurales perdidas por muerte celular. Aunque se ha intentado el trasplante de células neurales en experimentos animales usando embriocitoblastos o neurocitoblastos adultos, células ES y células neurales embrionarias, dichos usos se enfrentan a impedimentos importantes con respecto a su aplicación en seres humanos. Los problemas éticos que rodean el uso de embriocitoblastos o células neurales, y la cuestión de garantizar un suministro estable es también un problema. La demostrada capacidad de las células ES de diferenciarse está atrayendo actualmente mucha atención, pero, además de los numerosos problemas éticos, el coste y la mano de obra necesarios para inducir la diferenciación en tipos de células específicos y el riesgo de formar tumores teratoides tras el trasplante son factores que impiden la aplicación estable de esta tecnología. Para usar neurocitoblastos adultos, deben extraerse mediante craneotomía debido a que se encuentran en una sección nuclear muy limitada del sistema nervioso central, y de esta manera, los pacientes que experimentan un tratamiento regenerativo están también expuestos a un tremendo riesgo y carga.

Aunque han pasado aproximadamente 10 años desde el aislamiento in vitro de citoblastos del sistema nervioso central, aún no ha sido posible mediante los protocolos actualmente aceptados diferenciar los neurocitoblastos y obtener grandes cantidades de neuronas dopaminérgicas o colinérgicas (Lorenz Studer, Nature Biotechnology Dec. Issue, p. 117 (2001) .

Un grupo de investigación liderado por los profesores Samuel Weiss de la Calgar y University (Canadá) y Tetsuro Shingo ha tenido éxito en inducir eficazmente la diferenciación de las células neurales productoras de dopamina administrando una mezcla de varios factores inductores de la tirosina hidroxilasa (cóctel TH) en cerebros de ratones. Se ha publicado también la diferenciación de células estromales de médula ósea (BMSC) en células precursoras neurales que comprende la adición de agentes potenciadores del AMPc del tipo AMP dibutiril cíclico (AMPdbc) o isobutilmetilxantina (IBMX) al medio (Deng y col., 2001, Biochemical And Biophysical Research Communications 282, 148-152) .

Las neuronas motoras son acetilcolinérgicas, y se ha considerado su aplicación a enfermedades intratables tales como ELA (esclerosis lateral amiotrófica) . En la ELA, la muerte de las neuronas motoras de la médula espinal por motivos que son aún desconocidos conduce a la pérdida de los nervios que controlan los músculos, impidiendo de 45 esta forma el movimiento de los músculos a lo largo del cuerpo incluyendo los músculos respiratorios, y conduciendo a la muerte del paciente en los 2-3 años después del inicio. Actualmente, no existe tratamiento eficaz para esta dolencia, pero se han establecido modelos de ELA en ratas.

Las enfermedades musculares más degenerativas tales como la distrofia muscular son progresivas, y por tanto el trasplante de células musculares esqueléticas puede constituir un tratamiento eficaz. En individuos sanos, las células satélite presentes en el tejido muscular suplementan el músculo esquelético que ha perdido su capacidad regenerativa, pero en enfermedades musculares progresivas, el número de dichas células se reduce y la capacidad regenerativa es por lo tanto menor. De esta manera, aunque se puede usar el trasplante de células del músculo esquelético o de sus células precursoras como tratamiento, no existen aún medios curativos eficaces.

En el curso del desarrollo del sistema nervioso central, las neuronas y las células gliales son inducidas a diferenciarse a partir de células precursoras neurales o neurocitoblastos relativamente homogéneos. Un mecanismo está activo si algunas de las células incluidas en la población celular precursora se diferencian en determinados subtipos celulares en respuesta a señales de diferenciación, mientras que el resto de células permanecen indiferenciadas. De forma específica, las células anteriormente diferenciadas envían determinadas señales a las células que las rodean para evitar la diferenciación adicional en células de su propio tipo. Este mecanismo se conoce como inhibición lateral. En Drosophila, las células ya diferenciadas en neuronas expresan el ligando “Delta” mientras que las células que las rodean expresan el receptor delta “Notch”, y la unión del ligando con el receptor asegura que las células que los rodean no se diferencian en células neurales (señalización Notch) . El sistema Delta

Notch parece funcionar también en células de la médula espinal (véase, por ejemplo, Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C.: Nature, 375, 761-766 (1995) ) .

Se piensa que la interacción celular mediante la proteína de membrana Notch juega un papel principal en el proceso de desarrollo por medio de la cual un grupo celular homogéneo produce muchos tipos diversos, y, de forma específica, que tras la estimulación del ligando por células adyacentes, Notch induce la expresión de HES1 o HES5 que inhiben los factores de neurodiferenciación bHLH (hélice básica-bucle-hélice) tales como Mash1, Math1 y

neurogenina, para suprimir la diferenciación en el mismo tipo celular que la célula adyacente (véase, por ejemplo, Kageyama y col., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol.18, No.9, 1301-1306 (1999) ) .

La ruta intracelular de Notch se entiende actualmente como sigue. Cuando Notch se activa por primera vez mediante ligandos situados en la superficie de las células adyacentes (Delta, Serradas, Dentadas) , su dominio intracelular se escinde (Artavanis-Tsakonas S. y col.: Science (1999) 284:770-776 y Kageyama y col., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, Nº.9, 1301-1306 (1999) ) . Tras la escisión del dominio intracelular de Notch, este migra desde la membrana celular al núcleo con la ayuda de una señal de localización nuclear (SLN) y en el núcleo forma un complejo con la proteína de unión a ADN RBP-J! (Honjo T.: Genes Cells (1996) 1:1-9 y Kageyama y col., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol.18, Nº 9, 1301-1306 (1999) ) . La propia RBP-J! es un represor de la transcripción por

unión a ADN y, en ausencia de Notch activado, se une al promotor del gen HES1 que es un factor de inhibición de la diferenciación, bloqueando de este modo su expresión; sim embargo, una vez que se forma el complejo entre RBP-J! y el dominio intracelular de Notch, el complejo actúa en vez de activar la transcripción del gen HES-1 (véase Jarriault S. y col.: Nature (1995) 377: 355-358, Kageyama R. y col.: Curr. Opin. Genet. Dev. (1997) 7: 659-665 y Kageyama y col., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, Nº 9, 1301-1306 (1999) ) . Esto da como resultado la expresión de HES1 y la supresión inducida por HES1 de la diferenciación. En otras palabras, se cree que Notch suprime la diferenciación mediante HES1 (véase Kageyama y col., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, Nº 9, 1301-1306 (1999) ) .

También en mamíferos, ha llegado a ser evidente que la regulación mediada por Notch de la expresión génica es importante en el mantenimiento de las células precursoras neurales o los neurocitoblastos y en el muy diverso proceso de la diferenciación neural, y que la ruta de Notch es también esencial para la diferenciación de células diferentes de las del sistema nervioso (véase Tomita K. y col.: Genes Dev. (1999) 13: 1203-1210 y Kageyama y col., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol. 18, No.9, 1301-1306 (1999) ) . Además, se han anticipado también la existencia de una ruta de Notch independiente de HES, la regulación negativa de la señalización de Notch sobre el nivel de transcripción y la interacción negativa en el nivel de la proteína (véase Goh, M., Saibo Kogaku [Cell Engineering] Vol.18, Nº 9, 1291-1300 (1999) ) . Adicionalmente, todas las publicaciones anteriormente mencionadas tanto enseñan como sugieren que la señalización de Notch actúa en una dirección que suprime la diferenciación.... [Seguir leyendo]

1. Un método para inducir células estromales de médula ósea (BMSC) a diferenciarse en células precursoras neurales in vitro que comprende las etapas de: 5

(1) aislar BMSC procedentes de médula ósea, y cultivar dichas células en un medio de cultivo esencial normalizado suplementado con un suero; e

(2) introducir en dichas células, unas secuencias que comprenden un ácido nucleico que codifica un dominio intracelular de Notch, y cultivar adicionalmente dichas células para producir células precursoras neurales.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dichas BMSC aisladas se derivan de un ser humano.

3. Una población de células precursoras neurales producida mediante el método de acuerdo con la reivindicación 1 o

2, donde los miembros de la población de células precursoras neurales comprenden un dominio intracelular de 15 Notch, donde además, las células no expresan el dominio extracelular de Notch.

4. La población de células precursoras neurales de la reivindicación 3, donde los miembros de la población de células precursoras neurales expresan los marcadores de células precursoras neurales, GLAST, 3PGDH, y nestina.

5. Un método para inducir BMSC a diferenciarse en células neurales in vitro que comprende las etapas de:

(1) aislar BMSC procedentes de médula ósea, y cultivar dichas células en un medio de cultivo esencial normalizado suplementado con un suero;

(2) introducir en dichas células, secuencias que comprenden un ácido nucleico que codifican un dominio 25 intracelular de Notch y cultivar además dichas células; y

(3) añadir un agente que aumenta el monofosfato de adenosina cíclico /AMPc) o un análogo de AMPc, y/o un factor estimulador de la diferenciación celular a dicho medio de cultivo, y cultivar además dichas células para producir las mencionadas células neurales, donde las células diferenciadas resultantes son progenie de las BMSC donde se han introducido las secuencias que comprenden dicho ácido nucleico que codifica un dominio intracelular de Notch.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, donde dicha introducción de las secuencias que comprenden dicho ácido nucleico que codifica un dominio intracelular de Notch se lleva a cabo mediante lipofección con un vector que se puede expresar en un mamífero.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, que comprende además, entre la Etapa (2) y la Etapa (3) , una etapa de selección de células donde se ha introducido dicho ácido nucleico, durante un periodo predeterminado de tiempo.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde dicho factor estimulador de la diferenciación celular se selecciona entre el grupo que consiste en un factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) y sus mezclas.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5-8, donde dichas BMSC se derivan de un ser humano. 45

10. El método de la reivindicación 5, que comprende además las etapas de:

(4) cultivar las células neurales obtenidas en la Etapa (3) en un medio de cultivo esencial normalizado suplementado con un suero; y

(5) añadir un factor neurotrófico derivado de glía (GDNF) y un agente que aumenta el AMPc o un análogo de AMPc, y/o un factor estimulador de la diferenciación celular diferente de dicho GDNF a dicho medio de cultivo, y cultivar adicionalmente dichas células para obtener neuronas dopaminérgicas.

donde las neuronas dopaminérgicas resultantes son progenie de las BMSC donde se ha introducido dicho ácido 55 nucleico.

11. El método de la reivindicación 5, que comprende además las etapas de:

(4) cultivar las células naturales obtenidas en la Etapa (3) en un medio de cultivo esencial normalizado suplementado con un suero; y

(5) añadir factor de crecimiento del nervio (NGF) , y un agente que aumenta el AMPc o un análogo de AMPc y/o u factor estimulador de la diferenciación celular diferente de dicho NGF a dicho medio de cultivo y cultivar adicionalmente las mencionadas células para obtener neuronas acetilcolinérgicas,

donde las neuronas acetilcolinérgicas resultantes son progenie de las BMSC donde se ha introducido dicho ácido nucleico

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde dichas BMSC se derivan de un ser humano.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-12 donde dicho agente que aumenta el AMPc o análogo de

AMPc, en la etapa (3) es forskolina. 5

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde dicho factor estimulador de la diferenciación celular, en la etapa (3) , se selecciona entre el grupo que consiste en el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) el factor neurotrófico ciliar (CNTF) , y sus mezclas.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-15, donde dicho medio de cultivo esencial normalizado en la Etapa (4) es un medio alfa esencial mínimo modificado por Eagle.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-15 donde dicho suero en la Etapa (4) es suero

de feto de ternera. 15

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-16 donde dicho agente que aumenta el AMPc o análogo de AMPc es la Etapa (5) es forskolina.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-17, donde dicha concentración de dicho agente que aumenta el AMPc o análogo de AMPc en la Etapa (5) está entre 0, 001 nM y 100 microM.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12-18, donde dicho factor estimulador de la diferenciación celular diferente de dicho GDNF en la Etapa (5) se selecciona entre el grupo que consiste en el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) , el factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA) , y sus

mezclas

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12-19, donde una concentración de dicho GDNF en la Etapa (5) está entre 1 ng/ml y 100 ng/ml.

21. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12-20, donde una concentración de dicho factor estimulador de la diferenciación celular diferente de GDNF en la Etapa (5) está entre 0, 001 ng/ml y 100 microgramos/ml.

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-18, donde dicho factor estimulador de la

diferenciación celular diferente de NGF en la Etapa (5) se selecciona entre el grupo que consiste en el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) , el factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA) , y sus mezclas.

23. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-18 o 22, donde una concentración de dicho NGF en la Etapa (5) está entre 1 ng/ml y 100 ng/ml.

24. el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-20, 24 o 25, donde una concentración de dicho factor estimulador de la diferenciación celular diferente de NGF en la Etapa (5) está entre 0, 001 ng/ml y 100 microgramos/ml.

25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9, donde dicho medio de cultivo esencial normalizado es un medio alfa esencial mínimo modificado por Eagle.

26. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9 o 25, donde dicho suero es suero de feto de ternera.

27. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9, 25 o 26, donde dicho agente que aumenta AMPc o análogo de AMPc en la Etapa (3) es forskolina.

28. El método de acuerdo con cualquiera 5-9 .

2. 27, donde una concentración de dicho agente que aumenta el 55 AMPc o análogo de AMPc en la Etapa (3) está entre 0, 001 nM y 100 microM.

29. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9 .

2. 28, donde una concentración de dicho factor estimulador de la diferenciación celular está entre 0, 001 ng/ml y 100 microgramos/ml.

30. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de la población de células precursoras neurales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4 en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente que padece de una enfermedad, trastorno o dolencia implicada en el sistema nervioso central.

31. El uso de acuerdo con la reivindicación 30, donde dicha enfermedad, trastorno o dolencia es un daño en la 65 médula espinal inducido por lesión.