VECTOR DE EXPRESION PARA LA SECRECION DE UN FRAGMENTO DE ANTICUERPO USANDO UNA SECUENCIA SEÑAL DE E. COLI Y PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION EN SERIE DEL FRAGMENTO DE ANTICUERPO.

Un procedimiento para producir un fragmento de anticuerpo, que comprende los pasos de:



a) preparar un vector de expresión que comprende un gen que codifica una cadena ligera del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E. coli y un gen que codifica una cadena pesada del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de E. coli, en el que la expresión de los genes que codifican la cadena ligera y la cadena pesada está regulada por un único promotor;

b) transformar un microorganismo con el vector de expresión;

c) cultivar el microorganismo transformado en un medio; y

d) recoger el fragmento de anticuerpo segregado del microorganismo transformado dentro del medio o del espacio periplasmático del microorganismo

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W04002625KR.

Solicitante: HANMI PHARM. CO., LTD..

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: 893-5 HAJEO-RI, PALTAN-MYEON,HWASEONG-GUN, KYUNGKI-DO 445-9.

Inventor/es: LEE, GWAN, SUN, KWON, SE CHANG, JUNG, SUNG YOUB, KIM,JIN SUN.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 30 de Septiembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/24B
  • C12N15/70 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.

Clasificación PCT:

  • C07K16/28 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
  • C12N15/70 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.

Clasificación antigua:

  • C12N15/70 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.
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Fragmento de la descripción:

Vector de expresión para la secreción de un fragmento de anticuerpo usando una secuencia señal de E. coli y procedimiento para la producción en serie del fragmento de anticuerpo.

Campo de la invención

La presente invención versa acerca de un vector de expresión recombinante que expresa de forma secretora un fragmento de anticuerpo fusionado con una secuencia señal de E. coli en forma de heterocigoto soluble; acerca de un mecanismo transformado con el vector de expresión; y acerca de un procedimiento para producir en serie el fragmento del anticuerpo usando el microorganismo transformado.

Antecedentes de la invención

Un "fragmento de anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, significará la porción de un anticuerpo que comprende una región de enlace a antígenos, o una región variable de la misma. Fragmentos ejemplares de anticuerpo son los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y scFv. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de enlace a antígenos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un único sitio de enlace a antígenos, y un fragmento residual Fc. Cuando un anticuerpo es tratado con pepsina, se produce el fragmento F(ab')2, que tiene dos sitios de enlace a antígenos que sigue siendo capaz de formar reticulación. El fragmento Fab también contiene un dominio constante de la cadena ligera un primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de una región bisagra del anticuerpo.

Para modificar las propiedades inherentes de un anticuerpo aumentando la afinidad de enlace del anticuerpo, cambiando la antigenicidad o preparando un doble anticuerpo específico, se han estudiado diversos procedimientos para la producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos usando una técnica recombinante de genes. Como resultado, se ha desarrollado un procedimiento para producir y anticuerpo y fragmentos del mismo usando un sistema de expresión de E. coli. El procedimiento de producción que usa un sistema de expresión de E. coli tiene varias ventajas con respecto a otros procedimientos convencionales basados en el sistema de expresión de las células animales: 1) dado que construir un vector de expresión resulta más fácil, la expresión del mismo puede comprobarse con facilidad; 2) es posible producir en serie un anticuerpo a costo reducido debido a la rápida tasa de desarrollo de E. coli, lo que facilita contar con muestras de anticuerpos para estudios experimentales; y 3) la aplicación del procedimiento de fermentación relativamente simple puede dar pie a una comercialización más fácil que la de los procedimientos que emplean otras células huésped.

Ha habido varios informes de un gen codificante de anticuerpos introducido en E. coli y expresado en su interior (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277, 1984; y Boss et al., Nucleic Acids Res. 12: 3791-3806, 1984). Estos informes han dado a conocer que las moléculas de anticuerpo están expresadas a diversos rendimientos en un espacio citoplasmático, y también que puede usarse E. coli como célula huésped para expresar de forma secretora una cadena ligera de inmunoglobulina (Zemel-Dreasen et al., Gene 315-322, 1984) o para segregar un fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de fosfatasa alcalina o de ß-lactamasa en un espacio periplasmático (Pluckthun et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology Volume LII, 105-112, 1987). La Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/01059 enseña que el gen codificante de Fab' que reconoce un sitio específico de una célula cancerosa es expresado en forma de una proteína de fusión con la secuencia señal de la proteína A (OmpA) de la membrana exterior de E. coli; y la Patente U.S. Nº 5.648.237 da a conocer que el gen codificante de Fab' fusionado con la secuencia señal de enterotoxina de E. coli es expresado bajo el control de un promotor PhoA.

Un fragmento de anticuerpo expresado muestra una afinidad de enlace a antígenos similar a la de un anticuerpo de tipo salvaje; sin embargo, dado que es menor que el tipo salvaje, su invasividad local es más elevada (Blumenthal et al., Adv. Drug Del. Rev. 4: 279, 1990) y, dado que no contiene región Fc alguna, no se induce ningún efecto colateral cuando se administra a un cuerpo humano. En consecuencia, puede usarse un fragmento de anticuerpo para preparar un reactivo de diagnóstico o para desarrollar un anticuerpo terapéutico, y la producción en serio del mismo en E. coli se vuelve económicamente atractiva. En el caso de la preparación de un fragmento de anticuerpo a partir de un anticuerpo de tipo salvaje, el anticuerpo de tipo salvaje debe ser digerido con una proteinasa y purificado, lo cual es engorroso y económicamente desfavorable.

Sin embargo, hay varios problemas asociados con la producción de un fragmento de anticuerpo en E. coli. En primer lugar, no todos los fragmentos de anticuerpos pueden ser expresados en cantidad suficiente para los fines terapéuticos o diagnósticos perseguidos, y a veces es preciso repetir varias veces el procedimiento de cultivo. Además, para dotar al fragmento del anticuerpo de actividad funcional, tanto la cadena pesada como la cadena ligera tienen que estar expresadas en una única célula y mantener una forma heterocigota por medio de un enlace de bisulfuro formado entre ellas, lo que requiere que el fragmento del anticuerpo se exprese en una forma sumamente soluble, y no en forma de un cuerpo de inclusión, que se encuentra con frecuencia cuando una proteína se expresa en demasía en E. coli. Para resolver tales problemas, se ha estudiado de forma activa un procedimiento para segregar un fragmento de anticuerpo expresado en un espacio periplasmático usando una secuencia señal. Sin embargo, se ha informado de que no todos los fragmentos de anticuerpo fusionados con la secuencia señal son expresados de forma secretora en demasía en el espacio periplasmático de E. coli, y la cantidad del anticuerpo expresado varía muchísimo con la secuencia de nucleótidos de los mismos (Kelly et al., Biochemistry 31: 5434-5441, 1992; and Humphreys et al., Protein Expression and Purification 26: 309-320, 2002). También se ha descubierto que el patrón de expresión de un fragmento fluctúa dependiendo de la diferencia en el gen estructural del vector de expresión o de la distancia entre los genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera (Publicación de la Patente Internacional Nº WO 01/94585). Estos hechos sugieren que para la expresión de un fragmento de anticuerpo diana, es preciso que se mantenga un debido equilibrio en términos de la interacción entre el gen del anticuerpo diana y el gen estructural del huésped para la expresión y la interacción entre la diana y las secuencias señal en el caso de que se usen secuencias señal.

El documento WO 00/15661 y RIPPMANN J.F. ET AL.: "Procaryotic expression of single-chain variable-fragment (scFv) antibodies: secretion in L-form cells of Proteus mirablis leads to active product and overcomes the limitations of periplasmic expression in Escherichia coli" APPL. ENVIRON. MICROBIOL. vol. 64, no. 12, diciembre de 1998, páginas 4862-4869 dan a conocer un péptido señal de la enterotoxina II de E. coli modificada y una secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior para la secreción de proteína heteróloga, respectivamente.

El documento WO 03/018771 da a conocer un procedimiento para producir fragmentos de anticuerpo en células huésped, incluida E. coli, usando vectores con dos unidades traslacionales separadas que codifican las cadenas ligera y pesada. Se usa una secuencia señal para el transporte al periplasma, que puede proceder de genes, incluidos el OmpA y la enterotoxina II termoestable.

ANTHONY J ET AL: "PRODUCTION OF STABLE ANTI-DIGOXIN FV IN ESCHERICHIA-COLI" MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 29, nº 10. 1992, páginas 1237-1247, da a conocer un sistema bacteriano de expresión-exportación para expresar el fragmento (Fv) de región variable de un anticuerpo antidigoxina en E. coli. El plásmido contiene un promotor T7 y las secuencias señal de E. coli ompA y phoA (fosfatasa alcalina de E. coli) fusionadas a secuencias de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) para generar un cistrón artificial. Las proteínas VH y VL fueron escindidas...

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para producir un fragmento de anticuerpo, que comprende los pasos de:

    a) preparar un vector de expresión que comprende un gen que codifica una cadena ligera del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E. coli y un gen que codifica una cadena pesada del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de E. coli, en el que la expresión de los genes que codifican la cadena ligera y la cadena pesada está regulada por un único promotor;
    b) transformar un microorganismo con el vector de expresión;
    c) cultivar el microorganismo transformado en un medio; y
    d) recoger el fragmento de anticuerpo segregado del microorganismo transformado dentro del medio o del espacio periplasmático del microorganismo.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el fragmento de anticuerpo se deriva de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el fragmento de anticuerpo está seleccionado de entre el grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2 y scFv.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E. coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 17 y la secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de E. coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 24.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el promotor es un promotor T7 o un promotor Tac.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo antifactor de necrosis tumoral alfa.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el vector de expresión es pmsoDLHF_N/S.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el microorganismo es E. coli.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el microorganismo transformado con el vector de expresión es E. coli BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924) depositada bajo el número de acceso KCCM-10513.

10. Un vector de expresión que comprende un gen que codifica una cadena ligera del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E. coli y un gen que codifica una cadena pesada del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de E. coli, en el que la expresión de los genes que codifican la cadena ligera y la cadena pesada está regulada por un único promotor, y el fragmento de anticuerpo expresado a partir del vector de expresión es segregado a un medio de cultivo o un espacio periplasmático de un microorganismo.

11. El vector de expresión de la reivindicación 10, en el que el fragmento de anticuerpo se deriva de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

12. El vector de expresión de la reivindicación 10, en el que el fragmento de anticuerpo está seleccionado de entre el grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2 y scFv.

13. El vector de expresión de la reivindicación 10, en el que la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E. coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 17 y la secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de E. coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 24.

14. El vector de expresión de la reivindicación 10, en el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo antifactor de necrosis tumoral alfa.

15. El vector de expresión de la reivindicación 10, en el que el promotor es un promotor T7 o un promotor Tac.

16. El vector de expresión de la reivindicación 15 que es pmsoDLHF_N/S.

17. Un microorganismo transformado con el vector de expresión de la reivindicación 10.

18. El microorganismo de la reivindicación 17 que es E. coli.

19. El microorganismo de la reivindicación 18 que es E. coli BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924) depositada bajo el número de acceso KCCM-10513.


 

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