VACUNA SUBUNIDAD DE LAWSONIA INTRACELLULARIS.

Un ácido nucleico que codifica una proteína de Lawsonia intracellularis de 75 kD o una porción de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína,

teniendo dicho ácido nucleico o dicha porción del mismo una homología de al menos 90% con un ácido nucleico que tiene una secuencia como se representa en el SEQ ID NO: 1

Vacuna subunidad de Lawsonia intracellularis.

La presente invención se refiere entre otros a ácidos nucleicos que codifican proteínas de Lawsonia intracellularis novedosas, a fragmentos de ADN, a moléculas de ADN recombinante y a portadores recombinantes vivos que comprenden estas secuencias, a células anfitrionas que comprenden tales ácidos nucleicos, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y portadores recombinantes vivos, a proteínas codificadas por estas secuencias de nucleótidos y a su uso para la fabricación de vacunas, a vacunas para combatir las infecciones por Lawsonia intracellularis y a los métodos para su preparación y a ensayos de diagnóstico para la detección de antígenos de Lawsonia intracellularis y para la detección de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis.

La enteropatía proliferativa porcina (EPP o EP) se ha convertido en una importante enfermedad de la industria porcina moderna en todo el mundo. La enfermedad afecta del 15% al 50% de las piaras en desarrollo y hasta el 30% de los animales individuales en piaras establecidas con problemas. Actualmente las pérdidas económicas anuales se han estimado en 5-10 dólares americanos en alimentación extra y costes de tiempo en las instalaciones por cerdo afectado. La EPP es un grupo de afecciones crónicas y agudas de signos clínicos que difieren ampliamente (muerte, animales pálidos y anémicos, diarrea acuosa de color oscuro o rojo brillante, depresión, apetito reducido y renuencia al movimiento, retraso en el crecimiento y aumento de FCR). No obstante existen dos rasgos constantes. El primero, un cambio patológico solamente visible en la necropsia, es un engrosamiento de la mucosa del intestino delgado y del colon. El segundo es la aparición de pequeñas bacterias curvadas intracitoplasmáticas en los enterocitos del intestino afectado. Estas bacterias se han establecido ahora como agente etiológico de la EPP y se han denominado Lawsonia intracellularis.

A lo largo de los años se ha descubierto que Lawsonia intracellularis afecta a un gran grupo de animales incluyendo monos, conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos, y otros animales tan diversos como avestruces y emúes. Lawsonia intracellularis es una bacteria flagelada, gram negativa que se multiplica solamente en los enterocitos eucarióticos y no se ha descrito en ningún cultivo sin células. Con el fin de perdurar y multiplicarse en la célula Lawsonia intracellularis debe penetrar en las células de las criptas en división. La bacteria se asocia con la membrana celular y entra rápidamente en el enterocito a través de una vacuola de entrada. Ésta se rompe rápidamente (en 3 horas) y la bacteria prospera y se multiplica libremente en el citoplasma. Los mecanismos por medio de los cuales la bacteria hace que las células infectadas no logren madurar, continúen experimentando mitosis y formen criptas hipoplásticas todavía no se conocen. El conocimiento actual de la infección por Lawsonia intracellularis, el tratamiento y control de la enfermedad han estado impedidos por el hecho de que Lawsonia intracellularis no puede ser cultivada en medios sin células. Aunque existen informes de cultivos simultáneos satisfactorios de Lawsonia intracellularis en enterocitos de rata esto no ha conducido al desarrollo de vacunas inactivadas para combatir Lawsonia intracellularis, aunque existe claramente la necesidad de tales vacunas.

Se observa que el documento EP-A-1 219 711 describe secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de la membrana externa de Lawsonia intracellularis y fragmentos inmunogénicos para su uso como vacunas contra Lawsonia intracellularis. El documento WO-A-0 226 250 describe vacunas contra la ileitis proliferativa que contiene subunidades inmunogénicas protectoras de Lawsonia intracellularis.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna para combatir la infección por Lawsonia intracellularis. Se ha descubierto ahora sorprendentemente, que Lawsonia intracellularis produce una proteína novedosa que es capaz, por separado o combinada con otra cualquiera de ocho proteínas novedosas encontradas, de inducir inmunidad protectora contra Lawsonia intracellularis.

La primera de estas nueve proteínas novedosas, que es la proteína de la invención, será referida como la proteína de 75 kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 2. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 1. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 5074". La segunda de estas nueve proteínas novedosas será referida como la proteína de 27kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 4. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 3. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 5669".

La tercera de estas nueve proteínas novedosas será referida como la proteína de 62 kD.

La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 6. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 5. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 4423".

La cuarta de estas nueve proteínas será referida como la proteína de 57 kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 8. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 7. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 3123".

La quinta de estas nueve proteínas será referida como la proteína de 74 kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 10. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 9. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 5293".

La sexta de estas nueve proteínas será referida como la proteína de 44 kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 12. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 11. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 5464".

La séptima de estas nueve proteínas será referida como la proteína de 43 kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 14. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 13. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 5473".

La octava de estas nueve proteínas será referida como la proteína de 26/31 kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 16. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 15. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 4320".

La novena de estas nueve proteínas será referida como la proteína de 101 kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 18. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 17. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 2008".

Es bien sabido en la técnica, que muchas secuencias de ácido nucleico diferentes pueden codificar la misma proteína. Este fenómeno es conocido comúnmente como tambaleo en la segunda y especialmente la tercera base de cada triplete que codifica un aminoácido. Este fenómeno puede dar como resultado una heterología de aproximadamente 30% para dos secuencias de ácido nucleico que todavía codifican la misma proteína. Por lo tanto, dos secuencias de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de aproximadamente 70% todavía pueden codificar una y la misma proteína.

De este modo, una realización hace...

1. Un ácido nucleico que codifica una proteína de Lawsonia intracellularis de 75 kD o una porción de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha porción del mismo una homología de al menos 90% con un ácido nucleico que tiene una secuencia como se representa en el SEQ ID NO: 1.

2. Un fragmento de ADN que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, bajo el control de un promotor conectado funcionalmente.

4. Un portador recombinante vivo que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una célula anfitriona que comprende un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3 o un portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Una proteína de Lawsonia intracellularis de 75 kD, comprendiendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos en 90% a la secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 2, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína.

7. Una proteína de Lawsonia intracellularis de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en una vacuna.

8. El uso de una proteína de Lawsonia intracellularis de acuerdo con la reivindicación 6 para la fabricación de una vacuna para combatir las infecciones por Lawsonia intracellularis.

9. Una vacuna para combatir las infecciones por Lawsonia intracellularis, caracterizada porque comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, un portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 4, una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 5 o una proteína de acuerdo con la reivindicación 6, y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende un coadyuvante.

11. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, caracterizada porque comprende un antígeno adicional derivado de un virus o un microorganismo patogénico para cerdos o información genética que codifica dicho antígeno.

12. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque dicho virus o microorganismo patogénico para cerdos se selecciona del grupo del virus de la Pseudorrabia, virus de la Influenza porcina, Parvovirus porcino, virus de la Gastroenteritis transmisible, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Brachyspira hyodysenteriae y Actinobacillus pleuropneumoniae.

13. Una vacuna para combatir las infecciones por Lawsonia intracellularis, caracterizada porque comprende anticuerpos contra una proteína de acuerdo con la reivindicación 6.

14. Un ensayo diagnóstico para la detección de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis, caracterizado porque dicho ensayo comprende una proteína o uno de sus fragmentos como se define en la reivindicación 6.

15. Un ensayo diagnóstico para la detección de material antigénico de Lawsonia intracellularis, caracterizado porque dicho ensayo comprende anticuerpos contra una proteína o uno de sus fragmentos como se define en la reivindicación 6.