Utilización de uno o más genes o proteínas cas (asociados a CRISPR) para modular la resistencia en una bacteria frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a, inter alia, la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo. En particular, la presente invención se refiere, en un aspecto, a la utilización de uno o más genes o proteínas cas para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los cultivos, tales como los cultivos iniciadores, son muy utilizados en la industria alimentaria en la preparación de productos fermentados, incluyendo productos lácteos (tales como yogur, mantequilla y queso), productos cárnicos, productos de panadería, vino y productos vegetales. La preparación de cultivos es laboriosa, ocupa mucho espacio y requiere muchos equipos, y existe un riesgo considerable de contaminación por bacterias descomponedoras de los alimentos y/o fagos durante la etapa de propagación. El colapso de los cultivos bacterianos debido a la infección por bacteriófagos (fagos) y su multiplicación es un problema importante durante el uso industrial de los cultivos bacterianos. Existen muchos tipos diferentes de fagos con mecanismos diversos para atacar a las bacterias. Además, aparecen nuevas cepas de bacteriófagos.

Entre las estrategias utilizadas para minimizar la infección por bacteriófagos, y de esta manera el colapso de un cultivo bacteriano, se incluye la utilización de: (i) cultivos iniciadores mixtos, e (ii) la utilización alternativa de cepas que presentan diferentes perfiles de susceptibilidad a los fagos (rotación de cepas).

(i) Tradicionalmente, los cultivos iniciadores en la industria láctea son mezclas de cepas bacterianas del ácido láctico. La composición compleja de los cultivos iniciadores mixtos garantiza la presencia de un cierto nivel de resistencia al ataque fágico. Sin embargo, el subcultivo repetido de cultivos de cepa mixta conduce a cambios impredecibles en la distribución de las cepas individuales y finalmente a la dominancia no deseada de una cepa. Esto, a su vez, puede conducir a una susceptibilidad incrementada al ataque fágico y al riesgo de fracasos de la fermentación.

(ii) La rotación de cepas bacterianas seleccionadas que son sensibles a diferentes fagos es otro enfoque para limitar el desarrollo de fagos. Sin embargo, resulta difícil e incómodo identificar y seleccionar un número suficiente de cepas que presenten diferentes perfiles de tipo de fago para proporcionar un programa de rotación eficiente y fiable. Además, la utilización continua de cepas requiere el seguimiento cuidadoso para nuevos fagos infecciosos y la necesidad de sustituir rápidamente una cepa que se encuentra infectada por el nuevo bacteriófago por una cepa resistente. En las plantas de fabricación, en las que se preparan grandes cantidades de cultivos iniciadores en masa de antemano, este tipo de respuesta rápida habitualmente no resulta posible.

Se han realizado varios intentos para mejorar la resistencia de los cultivos para la utilización en la industria.

Pedersen et al. (7th Symposium on lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications, 1 a 5 de septiembre de 2002; Egmond aan Zee, Países Bajos) enseñan una cepa de Lactococcus lactis resistente a fagos que no presenta actividad de timidilato sintasa y que requiere timidina para la replicación del ADN.

La patente WO 01/14520 da a conocer una bacteria del ácido láctico que presenta una susceptibilidad reducida al ataque por como mínimo un tipo de bacteriófago. Dichas bacterias del ácido láctico comprenden un gen mutado implicado en el metabolismo de las piridinas, es decir pyrG, que resulta en un defecto en la CTP-sintetasa.

Kosuge et al. (Appl. Environ. Microbiol. volumen 64, número 11, páginas 43284332, 1998) y Kosuge et al. (FEMS Microbiology Letters 123(1/2):55-62, 1994) enseñan una bacteria Thermus thermophilus HB27 que se encuentra mutada en el gen proB y que es incapaz de utilizar la prolina para el crecimiento.

Sin embargo, existe una necesidad todavía de mejorar los cultivos para la utilización en la industria.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En la presente memoria se describe la utilización de loci CRISPR o un componente de los mismos para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Las CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y uniformemente espaciadas) (también conocidas como SPIDR -repeticiones directas intercaladas por espaciadores) constituyen una familia de loci de ADN recientemente descrita. Los loci CRISPR están consituidos por repeticiones de ADN cortas y altamente conservadas (típicamente de 24 a 40 pb, repetidas 1 a 140 veces) que son parcialmente palindrómicas. Las secuencias repetidas (habitualmente específicas de una especie) se encuentran separadas por secuencias variables de longitud constante (típicamente de 20 a 58 pb, dependiendo del CRISPR). Se han encontrado hasta 20 loci CRISPR diferentes en un solo cromosoma.

Aunque se desconoce la función biológica de los loci CRISPR, se han propuesto algunas hipótesis. Por ejemplo, se ha propuesto que podrían encontrarse implicadas en la unión del cromosoma a una estructura celular, o en la replicación del cromosoma y distribución de replicones (Jansen et al., 2002; Pourcel et al., 2005). Además, Mojica et al., 2005, han planteado la hipótesis de que CRISPR podría encontrarse implicado en proporcionar unidad específica contra el ADN foráneo, y Pourcel et al., (2005), han planteado la hipótesis de que los CRISPR son estructuras que pueden incorporar fragmentos de ADN foráneo como parte de un mecanismo de defensa. Bolotin et al., (2005), sugieren que los elementos espaciadores de CRISPR son trazas de invasiones pasadas por parte de elementos extracromosómicos, y han planteado la hipótesis de que proporcionan a la célula inmunidad frente a la infección por fagos, y más generalmente frente a la expresión de ADN foráneo mediante la codificación de un ARN antisentido. Bolotin et al., (2005), también sugieren que los genes cas resultan necesarios para la formación de CRISPR.

En contraste con las enseñanzas de la técnica anterior, que plantean la hipótesis de que CRISPR o los espaciadores de CRISPR podrían encontrarse implicados en proporcionar inmunidad específica, la presente invención se basa, en parte, en el inesperado resultado de que los genes o proteínas cas resultan necesarios para la inmunidad contra un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Todavía más inesperadamente, en el contexto de la presente invención se ha descubierto que uno o más genes o proteínas cas se encuentran asociados a dos o más repeticiones CRISPR dentro de los loci CRISPR. En otras palabras, los genes o proteínas cas aparentemente son específicos para una repetición CRISPR de ADN, implicando que los genes o proteínas cas y la secuencia repetida forman una pareja funcional. De acuerdo con lo anterior, puede utilizarse uno o más espaciadores de CRISPR conjuntamente con una o más de dichas parejas funcionales (es decir, repeticiones CRISPR y genes cas) con el fin de modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

En una forma de realización, para que uno o más espaciadores de CRISPR proporcione inmunidad a la célula, la repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes o proteínas cas forman una combinación funcional, es decir, la repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes o proteínas cas son compatibles.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, se sugiere en la presente memoria por primera vez que un gen o proteína cas influye sobre la resistencia, tal como la resistencia de una bacteria a uno o más bacteriófagos. En particular, el conocimiento de dos o más repeticiones CRISPR y/o de uno o más genes o proteínas cas para una célula dada resultará ventajoso para predecir, determinar y modificar su resistencia, por ejemplo su lisotipo, que define la resistencia/sensibilidad de una bacteria dada frente a diversos bacteriófagos. En consecuencia, la identificación y la detección de los loci CRISPR en, por ejemplo, las células y bacteriófagos, podrían ayudar a determinar, predecir y modificar el perfil de resistencia de una célula o las interacciones de fago-huésped.

Ventajosamente, la aplicación de uno o más loci de CRISPR, dos o más repeticiones CRISPR, uno o más genes o proteínas cas y/o uno o más espaciadores de...

Reivindicaciones

1. Utilización de uno o más genes o proteínas cas (asociados a CRISPR) para modular la resistencia en una bacteria frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que se utilizan dichos uno o más genes o proteínas cas en combinación con dos o más repeticiones CRISPR.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que dichos uno o más genes o proteínas cas y/o dichas dos o más repeticiones CRISPR proceden o son derivables a partir de la misma célula.

4. Utilización según la reivindicación 2 ó 3, en la que dichos uno o más genes o proteínas cas y dichas dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente en la misma célula.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos uno o más genes o proteínas cas son utilizados en combinación con uno o más espaciadores de CRISPR.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que el espaciador o espaciadores de CRISPR proceden o son derivables de un organismo que es diferente a la célula de la que proceden o son derivables dichos uno o más genes o proteínas cas y/o dos o más repeticiones CRISPR.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que el espaciador se obtiene a partir de una célula que es resistente a un ácido nucleico diana.

8. Utilización según la reivindicación 5, en la que el espaciador de CRISPR es una secuencia de ácido nucleico sintético.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que el espaciador o los espaciadores CRISPR presentan homología al ácido nucleico diana.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la que el espaciador o los espaciadores de CRISPR presentan una identidad de 100% respecto al ácido nucleico diana a lo largo de por lo menos la longitud del núcleo del espaciador de CRISPR.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho por lo menos un gen o proteína cas se utiliza en combinación con por lo menos uno o más espaciadores de CRISPR y por lo menos dos o más repeticiones CRISPR.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable (preferentemente derivado) de ADN de bacteriófago.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de ADN de plásmido.

14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de un elemento genético móvil.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de un elemento trasponible o una secuencia de inserción.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de un gen de resistencia a antibióticos.

17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de un ácido nucleico codificante de un factor de virulencia.

18. Utilización según la reivindicación 17, en la que el factor de virulencia se selecciona de entre el grupo constituido por ácidos nucleicos codificantes de una toxina, de una internalina y de una hemolisina.

19. Utilización según la reivindicación 1 de una secuencia de ácidos nucleicos recombinantes que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con por lo menos un espaciador de CRISPR, en la que por lo menos un espaciador de CRISPR es heterólogo respecto a por lo menos un gen cas y/o por lo menos dos repeticiones CRISPR, para modular la resistencia frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

20. Método para modular la resistencia de una bacteria frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes:

(i) identificar una secuencia en un organismo;

(ii) preparar un espaciador de CRISPR que es homólogo de la secuencia identificada;

(iii) preparar un ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con el espaciador de CRISPR; y

(iv) introducir dicho ácido nucleico en una célula, para convertir así a la célula en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

21. Método para modular la resistencia de una bacteria frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes:

(i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en un organismo resistente al ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo;

(ii) preparar un ácido nucleico recombinante que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con dichos uno o más espaciadores identificados; e

(iii) introducir dicho ácido nucleico recombinante en una célula, para la conversión así de la célula en resistente a dicho ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

22. Método según la reivindicación 20 ó 21, en el que los uno o más genes o proteínas cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR proceden o son derivables de la misma célula.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que los espaciadores proceden o son derivables a partir de un organismo que es diferente de la célula que comprende los uno o más genes o proteínas cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que dicho uno

o más genes o proteínas cas y las dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente de manera natural en la misma célula.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que dicha modificación comprende insertar uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR en la célula.

26. Método según la reivindicación 25, en el que el espaciador de la célula presenta una homología de 100% respecto al espaciador de CRISPR o el seudoespaciador de CRISPR del organismo.

27. Método según la reivindicación 25 ó 26, en el que dicha modificación comprende la ingeniería genética del espaciador de CRISPR de la célula.

28. Método según la reivindicación 27, en el que la totalidad o parte del espaciador en la célula ha sido modificado.

29. Método según la reivindicación 27 ó 28, en el que dicha modificación comprende la modificación de un espaciador recombinante.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el que dicha modificación se produce mediante mutación espontánea o mutagénesis.

31. Método para modular la resistencia de una bacteria que comprende por lo menos uno o más genes o proteínas cas y dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende modificar dichos uno o más genes o proteínas cas en la célula.

32. Método según la reivindicación 31, en el que dichos uno o más genes o proteínas cas en la célula se delecionan.