Una variante de la proteasa subtilisina que comprende una sustitución hecha en una o más posiciones en una proteasa subtilisina precursora correspondiente a K170D y/o S173D de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens

Proteínas mutantes con menor respuesta alergénica en seres humanos para construir, identificar y producir dichas proteínas.

Antecedentes de la invención

A. Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas que producen una respuesta alergénica menor en seres humanos expuestos a tales proteínas, y a una prueba predictiva de tal respuesta. Más específicamente, la presente invención se refiere a un nuevo mutante de proteína mejorado que produce respuestas alergénicas muy bajas en seres humanos sensibilizados a esa proteína mediante exposición, si se compara con el precursor de tal mutante de proteína.

B. Estado de la técnica

Cada vez predomina más la utilización de proteínas en aplicaciones industriales, farmacéuticas y comerciales. Como resultado, la mayor exposición debida a esta predominancia ha sido responsable de algunos riesgos relacionados con la seguridad causados por la sensibilización de ciertas personas a esos péptidos, con lo que la exposición subsiguiente causa reacciones alérgicas extremas que pueden ser perjudiciales e incluso fatales. Por ejemplo, se sabe que las proteasas causan una hipersensibilidad peligrosa en algunos individuos. Como resultado, a pesar de la utilidad de las proteasas en la industria, e.g. en detergentes para ropa, cosméticos, tratamientos textiles, etc..., y la numerosas investigaciones llevadas a cabo en el campo para proporcionar proteasas mejoradas que tengan, por ejemplo, una eliminación más eficaz de manchas bajo condiciones de detergencia, el uso de proteasas en la industria ha sido problemático debido a su capacidad para producir una respuesta alergénica hipersensible en algunos humanos.

Se ha realizado mucho trabajo para paliar estos problemas. Entre las estrategias exploradas para reducir el potencial inmunogénico del uso de proteasas están los procedimientos de producción mejorada que reducen el contacto potencial, controlando y minimizando las concentraciones en el lugar de trabajo de partículas de polvo o aerosol que llevan proteasas transportadas por el aire, los procedimientos de granulación mejorados que reducen la cantidad de polvo o aerosol producido en realidad a partir del producto proteasa, y los procedimientos de recuperación mejorados para reducir el nivel de contaminantes potencialmente alergénicos en el producto final. Sin embargo, los esfuerzos para reducir la alergenicidad de la proteasa, per se, han sido relativamente poco fructíferos. Alternativamente, se han realizado esfuerzos para ocultar epítopos en proteasas que se reconocen mediante inmunoglobulina E (IgE) en individuos hipersensibles (Publicación PCT Nº WO 92/10755) o para aumentar o cambiar la naturaleza de los determinantes antígenos mediante la unión de polímeros o péptidos/proteínas a la proteasa problemática.

Cuando ocurre una respuesta inmune adaptada en forma exagerada o inapropiada, el individuo experimenta una reacción denominada hipersensible. Las reacciones hipersensibles son consecuencia de respuestas normalmente beneficiosas actuando inapropiadamente y algunas veces causan reacciones inflamatorias y daño de tejido. Estas pueden ser provocadas mediante muchos antígenos; y la causa de la reacción hipersensible variará de un individuo a otro. La hipersensibilidad en sí misma normalmente no se manifiesta después del primer contacto con el antígeno, sino que normalmente aparece después de contactos sucesivos. Una forma de sensibilidad ocurre cuando una respuesta a IgE está dirigida contra antígenos medioambientalmente inocuos, tales como polen, ácaros o caspa animal. La producción resultante de mediadores farmacológicos por parte de las células mástil sensibilizadas con IgE produce una reacción inflamatoria aguda con síntomas tales como el asma o la rinitis.

De todas formas, una estrategia que comprenda modificar los sitios de la IgE generalmente no será satisfactoria para prevenir la causa de la reacción de sensibilización inicial. En consecuencia, tales estrategias, aunque quizás neutralicen o reduzcan la severidad de la reacción hipersensible subsiguiente no reducirá el número de personas que en realidad están sensibilizadas. Por ejemplo, cuando se sabe que una persona es hipersensible a cierto antígeno, la manera general y únicamente segura para tratar esta situación es aislar la persona hipersensible del antígeno lo más completamente posible. Ciertamente, cualquier otra acción podría ser peligrosa para la salud del individuo hipersensible. Así, mientras que es importante reducir el peligro de una proteína específica para un individuo hipersensible, para los propósitos industriales sería de mucho más valor convertir una proteína en incapaz de iniciar la reacción hipersensible inicial.

Los linfocitos T (células T) son claves en la inducción y regulación de las respuestas inmunes y en la ejecución de las funciones efectoras inmunológicas. Se sabe que la inmunidad específica contra agentes infecciosos y tumores depende de esas células y se cree que contribuyen a la curación de heridas. Por otra parte, un fallo en el control de estas respuestas puede conducir a autoagresión. En general, el antígeno se presenta a las células T en forma de células que presentan antígeno que, a través de una variedad de mecanismos de superficie celular, capturan y exponen el antígeno o antígeno parcial de manera adecuada para el reconocimiento del antígeno por las células T. Después que los receptores sobre la superficie de las células T (receptores de células T) reconozcan un epítopo específico las células T comienzan una serie de interacciones complejas, que incluyen la proliferación, que dan como resultado la producción de anticuerpos por parte de las células B. Mientras que las células T y las células B son ambas activadas por epítopos antigénicos que existen sobre una proteína o péptido dado, en realidad los epítopos reconocidos por estas células mononucleares generalmente no son idénticos. De hecho, el epítopo que activa una célula T para iniciar la creación de diversidad inmunológica, frecuentemente no es el mismo etítopo que es reconocido después por las células B en el curso de la respuesta inmunológica. Así, con respecto a la hipersensibilidad, mientras que la interacción antigénica específica entre la célula T y el antígeno es un elemento crítico en el inicio de la respuesta inmune a una exposición antigénica, las especificidades de esa interacción, i.e., el epítopo reconocido, normalmente no es relevante para el desarrollo subsiguiente de una reacción alérgica auténtica.

La publicación PCT Nº WO 96/40791 describe un procedimiento para producir conjugados polioxialquileno-polipéptido con una alergenicidad reducida, utilizando óxido de polioxialquileno como material de partida.

La publicación PCT Nº WO 97/30148 describe un conjugado polipéptido con alergenicidad reducida que comprende una molécula que transporta el polímero que tiene dos o más moléculas de polipéptido acopladas a ella.

La publicación PCT Nº WO 96/17929 describe un procedimiento para producir polipéptidos con alergenicidad reducida que comprende la etapa de conjugación de 1 a 30 polimoléculas al polipéptido padre.

La patente Nº WO 92/10755 describe un método para producir variantes de proteína que provocan una respuesta inmunogénica reducida en animales. En esta solicitud, se utilizaron las proteínas de interés, una serie de proteasas variantes de ellas, para inmunizar ratas. Entonces, el suero de las ratas se utilizó para medir la reactividad de los anticuerpos policlonales producidos y presentes en el suero inmunizado frente a la proteína de interés o sus variantes. A partir de estos resultados, fue posible determinar si los anticuerpos en la preparación eran comparativamente más o menos reactivos con la proteína y sus variantes, permitiendo así un análisis de qué cambios en la proteína tienen más posibilidad de neutralizar o reducir la capacidad de unir Ig. A partir de estas pruebas sobre ratas, se llegó a la conclusión que cambiando cualquiera de los 309 restos de subtilisina correspondientes a las posiciones 127, 128, 129, 130, 131, 151, 136, 151, 152, 153, 154, 161, 162, 163, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 186, 193, 194, 195, 196, 197, 247, 251, 261 dará como resultado un cambio en el potencial inmunológico.

La publicación PCT Nº WO 94/10191 describe proteínas poco alergénicas que comprenden formas oligoméricas de las proteínas monoméricas padre, en donde el oligómero sustancialmente ha retenido su actividad.

La técnica anterior ha proporcionado...

1. Una variante de la proteasa subtilisina que comprende una sustitución hecha en una o más posiciones en una proteasa subtilisina precursora correspondiente a K170D y/o S173D de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

2. La variante de la proteasa subtilisina según la reivindicación 1, que comprende además una sustitución en una o más posiciones en una proteasa subtilisina precursora equivalente a las seleccionadas del grupo que consiste en Y171Q, N76D, S103A, V104I, G159D, V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R, y T260A.

3. La variante de la proteasa subtilisina según la reivindicación 2, que se deriva de una subtilisina de Bacillus.

4. La variante de la proteasa subtilisina según la reivindicación 3 que se deriva de subtilisina de Bacillus lentus o de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

5. Un ADN que codifica una variante de la proteasa subtilisina de la reivindicación 1.

6. Un vector de expresión que codifica el ADN de la reivindicación 5.

7. Una célula hospedante transformada con el vector de expresión de la reivindicación 6.

8. Una composición de limpieza que comprende la variante de la proteasa subtilisina de la reivindicación 1.

9. Un pienso que comprende la variante de la proteasa subtilisina de la reivindicación 1.

10. Una composición para tratar un textil, que comprende la variante de la proteasa subtilisina de la reivindica- ción 1.

11. Una variante de la proteasa subtilisina según la reivindicación 1, que comprende los conjuntos de sustitución combinada seleccionados del grupo que consiste en las posiciones correspondientes a:

K170D/Y171Q/S173D;&newline; N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D;&newline; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H;&newline; V68A/N76D/S103AN104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R;&newline; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R; y&newline; V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

12. Un método para reducir la alergenicidad de una proteasa subtilisina, que comprende hacer una sustitución en una proteasa precursora en al menos una o más posiciones que corresponden a K170D, Y171Q y/o S173D de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, para producir una variante de la proteasa subtilisina que tiene menor alergenicidad que la proteasa subtilisina precursora.

13. Un método según la reivindicación 12, que comprende además hacer una o más sustituciones en la proteasa subtilisina precursora equivalente a las seleccionadas del grupo que consiste en N76D, S103A, V104I, G159D, V68A, T213R, A232V, Q236H, Q245R y T260A.

14. Un método según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde la proteína subtilisina precursora es una subtilisina de Bacillus.

15. Un método según la reivindicación 14, en donde la proteasa subtilisina precursora es subtilisina de Bacillus lentus o subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende modificar un ADN que codifica la proteasa subtilisina precursora para producir un ADN modificado que codifica la variante de la proteasa subtilisina.