Una celulosa mejorada que comprende una secuencia de aminoácido que se ha modificado a partir de una secuencia precursora de aminoácidos que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T.

reesei que se muestra en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene una termoestabilidad mejorada en comparación con una celulasa que tiene la secuencia precursora de aminoácidos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiera a proteínas mejoradas, y particularmente enzimas, que tienen características de estabilidad alteradas a través del reclutamiento de restos de una proteína homóloga o relacionada. También se describe un potente procedimiento que permite el desarrollo de 5 dichas proteínas mejoradas con gran precisión.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han practicado de forma extensa procedimientos para mejorar las características funcionales de las proteínas con el fin de mejorar la utilidad de las proteínas en diversas solicitudes. A menudo, dichas técnicas implican el uso de la ingeniería de proteínas y la mutagénesis específica de 10 sitio para aislar y seleccionar restos de aminoácidos específicos que, en base a las propiedades de de los aminoácidos específicos y/o la estructura de la proteína, parecen ser especialmente relevantes o se demuestra que son relevantes a través de evidencias experimentales. Por ejemplo, Estell y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.760.025, sugieren la modificación de enzimas oxidativamente inestables que confieren estabilidad aumentada alterando los restos que son particularmente susceptibles a oxidación, 15 es decir, metionina, lisina, triptófano y cisteína, entre otros. Koths y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.752.585, sugieren un método para mejorar la estabilidad de oxidación de una proteína terapéutica haciendo una sustitución aminoacídica conservativa para cada resto de metionilo susceptible a oxidación con cloramina T. Barr y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.732.973, sugieren sustituir la metionina del sitio activo de 1-antitripsina con un aminoácido oxidativamente estable. 20

Las técnicas adicionales que se han sugerido incluyen modelación por homología de proteínas frente a proteínas evolutivamente cerradas para proporcionar una base para la ingeniería de proteínas. Siezen y col., Protein Engineering, vol. 4, Nº 7, págs. 719-737 (1991) describen una estrategia para mejorar las propiedades de las proteasas usadas en procedimientos industriales incorporando o duplicando características de enzimas más estables en una diana. Además, estas técnicas requieren 25 que se imparta una propiedad de una proteína más deseable a una proteína menos deseable. Sin embargo, en la práctica, la proteína más deseable es la diana para la que se desea desarrollar las características mejoradas. Por lo tanto, no es posible alinear una proteína de este tipo con una más deseable. Esto da pie a los investigadores a buscar técnicas no basadas en el conocimiento para obtener una mejora. 30

Las estrategias de mutación no basadas en el conocimiento se vuelven necesarias cuando hay un falta de información sobre la proteína de interés o cuando fallan las técnicas basadas en el conocimiento. Las técnicas no basadas en el conocimiento típicas comprenden métodos bien conocidos, incluyendo mutagénesis aleatoria, PCR propenso a error y técnicas de transposición en el patrón de PCR, así como desarrollos más recientes, tales como la transposición descrita en Steamer y col., 35 Patente de Estados Unidos Nº 5.605.793. La mutagénesis aleatoria se ha usado durante muchos años con diversos niveles de éxito divulgados a lo largo de la bibliografía. Sin embargo, la mutagénesis aleatoria es una estrategia de acierto o fallo debido al gran número de mutantes posibles. Por ejemplo, una proteína de 300 aminoácidos tiene un número posible de mutantes aleatorios del orden de 30020. Preparar, expresar y detectar un gran número de mutantes de este tipo, incluso usando las técnicas de 40 detección actuales, es imposible. Las técnicas de evolución dirigida, tales como "transposición génica" como se describe por Stemmer u otras técnicas de desarrollo molecular se limitan por las combinaciones de mutantes disponibles. Sin embargo, las combinaciones de mutantes deben producirse de forma natural o usando mutagénesis aleatoria si el conocimiento sobre la proteína es insuficiente. Sin embargo, esta combinación de variantes se incluye potencialmente para proporcionar una combinación 45 centrada de forma óptima de diversos organismos necesarios para un grado de éxito razonable.

Ha habido un esfuerzo considerable en el campo de la ingeniería de proteínas para producir enzimas más estables. No obstante, dado el inmenso contenido de información presente en muchas proteínas importantes, deben desarrollarse procedimientos mejorados para enfocar de forma inteligente un conjunto de moléculas mutantes hacia un efecto específico para aprovechar al máximo la 50 gama de diversidad biológica. Según se describe a continuación, los inventores de la presente invención han desarrollado una nueva técnica de mutagénesis basada en el conocimiento que prevé excelentes probabilidades con relación a la producción de nuevas proteínas que tienen un rendimiento mejorado, es

decir, características funcionales. Gracias a la práctica de la técnica de la presente invención, es posible para un investigador desarrollar un conjunto centrado de mutantes a partir de los cuales se facilita la selección de una proteína "ganadora" deseable.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Al hacer frente el problema de mejorar el rendimiento de las proteínas con respecto a una 5 propiedad funcional específica, los investigadores a menudo se enfrentan a obstáculos significativos en cuanto a la determinación de las mutaciones apropiadas para hacer en una proteína. La falta de estructuras cristalinas de muchas proteínas y la incertidumbre involucrada en alineamientos de baja homología con respecto a una proteína comparativa para la que las estructuras cristalinas se conocen, son impedimentos significativos para las estrategias de mutación basadas en el conocimiento. Además, 10 las técnicas de mutagénesis aleatoria u otras estrategias de mutación no basadas en el conocimiento, tales como caldo molecular, a menudo aciertan o fallan proposiciones que requieren la exploración de números masivos de mutantes que incluso no garantizan que ocurra la mutagénesis óptica. Sin embargo, a menudo el investigador que busca mejorar una cierta característica de una proteína tiene a mano una familia de estructuras primarias relacionadas, la mayor parte de las cuales son inferiores en 15 rendimiento con respecto a la proteína que se busca mejorar. Esto surge naturalmente del hecho de que la mejor proteína a menudo se selecciona como la diana principal. Sin embargo, esta "mejor proteína" tiene fallos significativos, cuya mejora tendría grandes beneficios comerciales o industriales. Por lo tanto, el investigador se queda con el problema de determinar cómo modificar la proteína de forma que no afecte a las propiedades deseables de la proteína diana, pero mejorando otras propiedades. En este 20 contexto, los científicos en este documento determinaron que usando alineamientos con proteínas menos deseables, es decir, enzimas menos estables o menos activas, es posible deducir modificaciones de aminoácidos que tendrán una gran posibilidad de éxito en función de ser aceptadas por la "mejor proteína" y sin trastornar en absoluto las buenas propiedades de la misma. De hecho, a menudo de forma natural ya se ha determinado que la modificación seleccionada trabajará en el procedimiento para 25 el que se destina, la probabilidad de éxito es mucho mayor.

En este documento se describe un procedimiento para obtener proteínas que tienen características funcionales mejoradas, incluyendo, por ejemplo, estabilidad alcalina elevada, estabilidad del pH, estabilidad térmica, estabilidad oxidativa aumentada, actividad catalítica aumentada y unión al sustrato o diana mejorada. 30

Es un objeto de la presente invención proporcionar una proteína, por ejemplo, una enzima, que tiene estabilidad alcalina elevada, estabilidad del pH, estabilidad térmica, estabilidad oxidativa aumentada, actividad catalítica aumentada y unión al sustrato o diana mejorada.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una celulasa mejorada que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha modificado a partir de una secuencia de 35 aminoácidos precursores que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T. reesei mostrada en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene termoestabilidad aumentada en comparación con una celulasa que tiene...

1. Una celulosa mejorada que comprende una secuencia de aminoácido que se ha modificado a partir de una secuencia precursora de aminoácidos que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T. reesei que se muestra en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene una 5 termoestabilidad mejorada en comparación con una celulasa que tiene la secuencia precursora de aminoácidos.

2. Una secuencia de ADN que codifica una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2. 10

4. Una célula huésped que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un procedimiento para producir una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a) modificar una secuencia de ADN que codifica la secuencia precursora de aminoácidos para 15 producir una secuencia de ADN a modificada como se ha definido en la reivindicación 2 que codifica la celulasa mejorada;

(b) expresar la secuencia de ADN modificada en una célula huésped; y

(c) purificar la proteína de celulasa expresada.

6. Uso de una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1 en la reducción de una biomasa, 20 productos de limpieza o composiciones para el tratamiento textil.