Una celulasa aislada con una secuencia de aminoácidos consistente en la secuencia de aminoácidos según se establece en la Figura 1 E

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a un procedimiento para producir altos niveles de novedosas proteínas de celulasa truncadas en una célula hospedadora, a transformantes de una célula hospedadora producidas mediante técnicas de ingeniería genética; y a nuevas proteínas de celulasa producidas mediante dichos transformantes. Las nuevas proteínas 5 de celulasa son nuevos núcleos catalíticos de celulasa. Se desvela un tratamiento de tejidos que contienen celulosa con los dominios de núcleo de celulasa de la invención para ofrecer unas ventajas específicas de una redeposición reducida de pigmento y un incremento en la abrasión.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las celulasas son enzimas que hidrolizan los enlaces β-D-glucosídicos de las celulosas. Las enzimas 10 celulolíticas se han dividido tradicionalmente en tres clases principales: endoglucanasas, exoglucanasas o celobiohidrolasas y β-glucosidasas (Knowles, J. y col., TIBTECH 5: 255-261 (1987)). Se sabe que las celulasas son producidas por un gran número de bacterias, levaduras y hongos.

Entre las principales aplicaciones que se han desarrollado para el uso de enzimas celulolíticas están aquellas implicadas en la degradación de pulpa de celulosa (madera) en azúcares para la producción de (bio)etanol, tratamientos 15 textiles, como "lavado a la piedra" y "biopulido," y en composiciones detergentes. También se sabe que las celulasas son útiles en composiciones detergentes para eliminar la suciedad, es decir, para la limpieza. Por ejemplo, las Solicitudes de Gran Bretaña Nos 2.075.028, 2.095.275 y 2.094.826 ilustran un comportamiento limpiador mejorado con detergentes que tienen incorporados celulasa. Adicionalmente, la Solicitud de Gran Bretaña Nº 1.358.599 ilustra el uso de celulasa en detergentes para reducir el tacto áspero de los tejidos que contienen algodón. 20

Otra característica útil de las celulasas en el tratamiento de textiles es su capacidad de reacondicionar tejidos usados haciendo sus colores más vivos. Por ejemplo, el lavado repetido de tejidos que contienen algodón da como resultado un engrisamiento del tejido. Se cree que esto es debido a fibrillas desorganizadas y desordenadas, denominadas a menudo "bolitas," producidas por una acción mecánica. Este engrisamiento es particularmente apreciable en tejidos de color. Como consecuencia, se ha encontrado que es valiosa la capacidad de la celulasa de 25 eliminar la desordenada capa superior de la fibra, y mejorar por tanto el aspecto global de la tela. Dado que los detergentes, que son una aplicación principal de la celulasa, operan generalmente en condiciones alcalinas, hay una fuerte demanda de celulasas que muestren una alta actividad a pH 7-10. Algunas celulasas fúngicas bien caracterizadas, tales como las de Humicola insolens y Trichoderma reesei, trabajan adecuadamente a un pH neutro y alcalino bajo. Se han aislado numerosas enzimas que muestran una actividad de celulasa a un pH altamente alcalino a 30 partir de Bacillus y otros procariotas, véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT Nos WO96/34092 y WO96/34108. Por lo tanto, se han investigado tanto celulasas fúngicas como bacterianas profundamente. Sin embargo, un tercer grupo de celulasas, las aisladas a partir de Actinomycetes, ha atraído sólo una exigua atención. Wilson, y col., Critical Reviews in Biotechnology, 12: 45-63 (1992), han estudiado las celulasas producidas por Thermomonospora fusca, Thermonomospora curvata y Microbispora bispora y han demostrado que muchas de estas celulasas muestran amplios 35 perfiles de pH y una buena estabilidad frente a la temperatura. De forma similar, Nakai, y col., Agric. Biol. Chem., 51: 3061-3065 (1987) y Nakai, y col., Gene, 65: 229-238 (1988) han mostrado la celulasa alcalinotolerante casA de la cepa KSM-9 de Streptomyces. Esta celulasa posee un pH óptimo alcalino y una excelente estabilidad frente a la temperatura.

A pesar de los conocimientos en la materia relacionados con muchas composiciones de celulasa con propiedades deseables, incluyendo algunos ejemplos procedentes de Actinomycetes, hay una continua necesidad de 40 nuevas celulasas con un espectro variable de características útiles como, por ejemplo, tratamientos textiles, componentes de composiciones detergentes, tratamientos de pulpa y papel, complementos alimenticios para animales, coadyuvantes del procesado en panadería, y convertidores de biomasa. Los solicitantes han descubierto celulasas que poseen dicho complemento de características y que son útiles en dichas aplicaciones conocidas de las celulasas.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN 45

La presente invención se refiere a un dominio de núcleo catalítico de celulasa, a construcciones, vectores y células hospedadoras que comprenden una o más de las secuencias promotoras unidas operativamente a una secuencia codificante heteróloga.

Consecuentemente, en un aspecto, la presente invención proporciona una celulasa aislada con una secuencia de aminoácidos consistente en la secuencia de aminoácidos según se establece en la Figura 1E. Esta celulasa tiene 50 excelentes propiedades para su uso en detergentes, el tratamiento de textiles, como complemento alimenticio y en la elaboración de pulpa y papel, según se desvelará posteriormente en este documento.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una secuencia de ADN que codifica la celulasa que tiene la secuencia de ácidos nucleicos según se establece en la Figura 2. En aspectos adicionales, la presente invención proporciona la expresión que comprende el ADN establecido en la Figura 2, tal como es el vector pKB107, y 55 células hospedadoras que han sido transformadas con un vector que comprende el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2. En una realización, cuando la célula hospedadora es de una especie de

Streptomyces, la célula hospedadora puede tener opcionalmente delecionado el gen cyc2 (gen de la vía de la geosmina).

La presente invención también se refiere a procedimientos y usos de las celulasas reivindicadas. Los procedimientos pueden usarse para el tratamiento de tejidos que contienen celulosa con dominios del núcleo de celulasa según se define en la reivindicación 1. Los procedimientos y usos proporcionan las ventajas específicas de una 5 redeposición reducida de pigmento, un incremento en la abrasión, un tacto mejorado del tejido (es decir, un ablandamiento), una superficie del tejido más suave, la eliminación de bolitas y/o la prevención de bolitas.

En otros aspectos, los procedimientos y usos de las celulasas reivindicadas son para incrementar la digestibilidad de alimento para animales, en detergentes, en el tratamiento de pulpa y papel, y en la producción de almidón y el tratamiento de subproductos del mismo. 10

Sin embargo, debería entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican las realizaciones preferidas de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración, dado que a partir de esta descripción detallada el experto en la materia apreciará diversos cambios y modificaciones dentro del ámbito y el espíritu de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 15

La Figura 1 ilustra las diversas proteínas celulasas. La Figura 1A es la pre-proteína.

La Figura 1B es la proteína celulasa 11 AG8 madura. La Figura 1C es la proteína celulasa de 233 aminoácidos 11AG8 sin el CBD. La Figura 1D es la proteína celulasa de 230 aminoácidos 11AG8 sin el CBD. La Figura 1E es el núcleo catalítico de celulasa de 221 aminoácidos 11AG8, es decir, sin el CBD o el conector. La secuencia de señalización está en rosa. El conector tiene 12 aminoácidos de longitud con 9 residuos en marrón y 3 en rojo. Los tres aminoácidos que 20 en la proteína de 233 aminoácidos (y subrayados sólo en la Fig. 1A) están en rojo. El CBD está en azul.

La Figura 2 es una secuencia de ADN que codifica el núcleo catalítico de 221 aminoácidos de la celulasa 11AG8.

La Figura 3 muestra el vector pSEGCT11 AG8 que incluye:

un promotor de glucosa isomerasa derivado de Actinoplanes missouriensis,

una secuencia de señalización de la celulasa de S. lividans, celA, 25

un polinucleótido que codifica el gen de la celulasa 11AG8 de una especie de Actinomyces,

una... [Seguir leyendo]

1. Una celulasa aislada con una secuencia de aminoácidos consistente en la secuencia de aminoácidos según se establece en la Figura 1 E.

2. La celulasa según la reivindicación 1, en la que dicha celulasa está codificada por una secuencia de ADN según se establece en la Figura 2. 5

3. Una secuencia de ADN aislado con la secuencia de ácidos nucleicos establecida en la Figura 2.

4. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN según la reivindicación 3.

5. El vector de expresión según la reivindicación 4, en el que el vector de expresión comprende adicionalmente un promotor aprE o un promotor glaA o un promotor A4 unido operativamente a la molécula de ADN.

6. El vector de expresión según la reivindicación 5, en el que el vector de expresión comprende el promotor A4 unido 10 operativamente a la molécula de ADN.

7. Una célula hospedadora transformada con el vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 7, en la que la célula hospedadora es una especie de Streptomyces o una especie de Bacillus; o la célula hospedadora es una especie de Streptomyces en la que ha sido delecionado el gen cyc2 (gen de la vía de la geosmina); o la célula hospedadora es un hongo filamentoso tal como Aspergilus o Trichoderma o 15 una levadura tal como Saccharomyces.

9. Una composición que comprende una celulasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

10. La composición según la reivindicación 9, en la que la composición es una composición detergente.

11. Una composición detergente que comprende una celulasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

12. Un procedimiento para producir una enzima con actividad celulasa, que comprende: 20

(a) transformar establemente una célula hospedadora aislada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6;

(b) cultivar dicha célula hospedadora transformada en unas condiciones adecuadas para que dicha célula hospedadora produzca dicha enzima; y

(c) a recuperar dicha enzima. 25

13. Un procedimiento para producir una celulasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, comprendiendo el procedimiento:

(a) hacer crecer una célula hospedadora transformada según la reivindicación 12 en unas condiciones adecuadas para la expresión de dicho ADN que codifica dicha celulasa; y

(b) recoger la mezcla acuosa resultante que comprende dicha celulasa. 30

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha celulasa es adicionalmente purificada a partir de dicha mezcla acuosa.

15. El procedimiento según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que dicha célula hospedadora es una especie de Bacillus spp o una especie de Streptomyces spp.

16. Un procedimiento para tratar tejidos que contienen celulosa, que comprende una etapa de poner en contacto los 35 tejidos que contienen celulosa con la celulasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que:

(i) el tratamiento es lavado a la piedra; o

(ii) el tratamiento es proporcionando una variación localizada en el color de tejidos coloreados que contienen celulosa; o 40

(iii) el tratamiento es proporcionando efectos de pulido superficiales en los tejidos que contienen celulosa; o

(iv) el tratamiento proporciona un tacto mejorado de los tejidos que contienen celulosa; o

(v) el tratamiento proporciona una clarificación del color de los tejidos que contienen celulosa; o

(vi) el tratamiento de los tejidos se realiza mediante remojo, lavado o aclarado de los tejidos.

18. Un procedimiento para tratar pulpa de papel, que comprende una etapa de poner en contacto la pulpa de papel con la celulasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

19. Un procedimiento para mejorar la digestibilidad de un alimento para animales, que comprende una etapa de tratar un alimento que contiene celulasa con la celulasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 5

20. El uso de la celulasa según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 como un aditivo para alimento para animales, para el tratamiento de textiles, en el tratamiento de pulpa y papel o en una composición detergente.