Inducción de la expresión génica utilizando una mezcla de azúcares a alta concentración.

Un método para preparar una composición de alimentación inductora,

para inducir la expresión de un genbajo el control de un promotor inducible por soforosa o un promotor inducible por gentiobiosa, comprendiendo dichométodo las etapas de

(a) proporcionar un preparado de celulasa completa de Trichoderma reesei que es un caldo de fermentaciónfinal, opcionalmente aislado de las células de la fermentación;

(b) mezclar una solución de glucosa pura que comprende de 50% a 75% (p/p) de glucosa con el preparado decelulasa completa de Trichoderma reesei para dar una primera mezcla, teniendo la primera mezcla una actividad debeta-glucosidasa de 1,5 UI/ml a 180 UI/ml; y

(c) incubar la primera mezcla a una temperatura de 50°C a 75°C y durante un tiempo suficiente para producir lacomposición de alimentación inductora;

en donde el preparado de celulasa completa comprende

(i) una o más beta-glucosidasas; y

(ii) una o más endoglucanasas y una o más celobiohidrolasas;

en donde la composición de alimentación inductora comprende soforosa en una concentración que se encuentra enel intervalo de 2 g/L a 25 g/L, y gentiobiosa en una concentración que se encuentra en el intervalo de 35 g/L a 60g/L.

Inducción de la expresión génica utilizando una mezcla de azúcares a alta concentración

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas.

Esta solicitud reivindica la prioridad a la Solicitud Provisional de EE.UU. nº 60/409.466, presentada el 10 de septiembre 2002 (Expediente N º GC774P) .

Declaración sobre los derechos de invenciones realizadas bajo investigación y desarrollo de subvencion federal.

Partes de este trabajo fueron financiadas por el Subcontrato No. ZCO-0-30017-01 con el Laboratorio Nacional de Energía Renovable bajo el Contrato Principal Nº DE-AC36-99G010337 con el Departamento de Energía de los EE.UU. En consecuencia, el Gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta invención.

Campo de la invención Esta invención se refiere a métodos para mejorar la producción de proteínas a partir de un cultivo de células. Los inventores han descubierto componentes y condiciones de cultivo que hacen aumentar drásticamente la cantidad de proteína producida a partir de genes bajo el control de secuencias promotoras de genes de celulasa. Los métodos mejorados se pueden utilizar para la producción de proteínas codificadas por genes de celulasa de origen natural, así como de diversas construcciones heterólogas.

Fundamento de la invención Los hongos filamentosos y las bacterias celulolíticas producen enzimas de celulasa extracelular que confieren a los organismos la facultad de hidrolizar los enlaces glicosídicos ligados º- (1, 4) de la celulosa para producir glucosa. Estas enzimas proporcionan a los organismos la facultad de usar para el crecimiento celulosa, el polisacárido vegetal más abundante.

El hongo filamentoso, Trichoderma reesei, es un eficaz productor de enzimas de celulasa. Como tal, Trichoderma reesei ha sido explotado por su facultad de producir estas enzimas, que son valiosas en la preparación de productos tales como etanol combustible, ropa, detergentes, fibras y otros productos.

La mezcla celulolítica de proteínas de Trichoderma reesei está entre las rutas celulolíticas de microorganismos mejor caracterizadas. Las celulasas que comprenden estas mezclas se clasifican en dos amplias categorías: las endoglucanasas (EG) y las celobiohidrolasas (CBH) . La º-glucosidasa es parte también de la mezcla de celulasas de Trichoderma reesei.

El Trichoderma reesei ha sido explotado también por su capacidad para producir proteínas heterólogas. Los genes que codifican una proteína deseada pueden ser regulados cuando están unidos operativamente al promotor cbhl inducible de T. reesei. Polipéptidos extraños han sido segregados en Trichoderma reesei como fusiones con el dominio catalítico más la región del enlazador de cbh 1 (Nyyssonen et al., Bio/technology 11 : 591-595, 1993) .

La expresión de los genes que comprenden el sistema de celulasa está coordinada y regulada a nivel de la transcripción. Los miembros de este sistema actúan sinérgicamente y, como se indicó anteriormente, son necesarios para la eficiente hidrólisis de la celulosa para dar oligosacáridos solubles.

La expresión y la producción de los principales genes de la celulasa en Trichoderma, cbh1, cbh2, egl1 y egl2, depende de la fuente de carbono disponible para el crecimiento. Los genes de celulasa son reprimidos fuertemente por la glucosa y son inducidos varios miles de veces por celulosa o el disacárido soforosa. Desde luego, el nivel de expresión de la principal celobiohidrolasa 1 (cbh1) es regulado por exceso varios miles de veces en medios que contienen fuentes de carbono inductoras tales como celulosa o soforosa, en comparación con medios que contienen glucosa (llmen et al., App. Environ. Microbio., 1298-1306, 1997) .

La producción en escala comercial de enzimas de celulasa se hace mediante cultivo sólido o bien en cultivo sumergido, incluyendo procesos por cargas, de tanda alimentada, o de flujo continuo. El aspecto más problemático y costoso de la producción industrial de celulasa es proporcionar el inductor apropiado a Trichoderma. Como sucede con los experimentos a escala de laboratorio, la producción de celulasa en una escala comercial se induce desarrollando el hongo sobre la celulosa sólida o cultivando el organismo en presencia de un inductor de disacárido tal como la lactosa. Desgraciadamente, en una escala industrial los dos métodos de inducción presentan inconvenientes que tienen por resultado costes elevados que están asociados con la producción de celulasa.

La síntesis de celulasa está sujeta tanto a la inducción de la celulosa como a la represión de la glucosa. Así pues, un factor crítico que influye en el rendimiento de las enzimas de celulasa o de proteínas heterólogas bajo el control de un promotor inducible es el mantenimiento de un equilibrio adecuado entre el sustrato de celulosa y la concentración de glucosa; es crítico para obtener rendimientos comerciales razonables del producto del gen regulado. Aunque la celulosa es un inductor eficaz y barato, puede ser problemático el control de la concentración de glucosa cuando se cultiva el Trichoderma en celulosa sólida. A bajas concentraciones de celulosa, la producción de glucosa puede ser demasiado lenta para satisfacer las necesidades metabólicas del crecimiento celular activo y la función. Por otro lado, la síntesis de celulasa puede detenerse por la represión de glucosa cuando la formación de glucosa es más rápida que el consumo. Así pues, se requieren costosos sistemas de control de procesos para proporcionar la adición lenta del sustrato y la monitorización o vigilancia de la concentración de glucosa (Ju y Afolabi, Biotechnol. Prog., 91 - 97, 1999) . Por otra parte, puede ser difícil de lograr el suministro lento y continuo de sustrato como consecuencia de la naturaleza sólida de los materiales celulósicos.

Allen y Mortensen (Biotechnol. Bioeng., 2641-45, 1981) han señalado que 200 UI /ml de º-glucosidasa purificada de Aspergillus phoenicis cuando se incuban con un jarabe de glucosa al 50%, producen una solución con la capacidad de inducir la producción de celulasa cuando se usa como fuente de carbono. La purificación de la º-glucosidasa es a la vez laboriosa y cara. Además, estos autores utilizaron más de 20 veces la carga de º-glucosidasa en comparación con la utilizada en el presente trabajo.

Algunos de los problemas asociados con el uso de la celulosa como sustrato inductor pueden ser superados mediante el uso de sustratos e inductores solubles tales como la lactosa o la soforosa. La lactosa tiene que ser proporcionada en concentraciones altas para que funcione como inductor y fuente de carbono (véase Seiboth, et. Al., Mol. Genet. Genomics, 124-32, 2002) . La gentiobiosa puede servir también como inductor. La soforosa es un inductor más potente que la celulosa, pero la soforosa es cara y difícil de elaborar. Así, aunque es más fácil de manejar y controlar que la celulosa sólida, sin embargo la soforosa puede hacer el coste de producción de celulasas prohibitivamente caro y, por lo tanto, no es práctica para la producción de celulasa comercial. Toussaint et al.; Biotechnology Letters, vol. 12, nº 8, 1990, páginas 587-592, describe reacciones de reversión que tienen lugar con el sistema Trichoderma reesi CL-847. No se han descrito reacciones usando soluciones de glucosa pura. Claramente, existe la necesidad de una composición conveniente de sustrato soluble que también proporcione un método económico de inducción de celulasa en hongos filamentosos, por ejemplo, en Trichoderma reesei.

Además, la capacidad para regular los promotores inducibles para expresar bien sea genes endógenos o bien heterólogos con un agente inductor económico, supondría un gran beneficio comercial.

Breve sumario de la invención Se ha descubierto ahora que cuando se añade un preparado de celulasa completa a una solución de glucosa concentrada, y la composición se incuba durante al menos dos días a una temperatura de 50ºC a aproximadamente 65°C, se produce una mezcla de azúcares que contiene cantidades apreciables de un inductor de la expresión del gen de la celulasa. Sorprendentemente, la mezcla compleja resultante es suficiente para inducir la producción de celulasa tal cual, sin más purificación. Este descubrimiento es sorprendente ya que glucosa actúa como un represor de los genes de la celulasa en Trichoderma reesei. Este descubrimiento proporciona un inductor de la expresión del gen de la celulasa que es una alternativa barata a la lactosa o a la soforosa purificada, y una alternativa menos fastidiosa a la celulosa sólida para la producción de celulasas en Trichoderma reesei.

En el presente texto se describe una composición para la inducción de la expresión de genes cuya expresión... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una composición de alimentación inductora, para inducir la expresión de un gen bajo el control de un promotor inducible por soforosa o un promotor inducible por gentiobiosa, comprendiendo dicho método las etapas de

(a) proporcionar un preparado de celulasa completa de Trichoderma reesei que es un caldo de fermentación final, opcionalmente aislado de las células de la fermentación;

(b) mezclar una solución de glucosa pura que comprende de 50% a 75% (p/p) de glucosa con el preparado de celulasa completa de Trichoderma reesei para dar una primera mezcla, teniendo la primera mezcla una actividad de beta-glucosidasa de 1, 5 UI/ml a 180 UI/ml; y

(c) incubar la primera mezcla a una temperatura de 50°C a 75°C y durante un tiempo suficiente para producir la composición de alimentación inductora;

en donde el preparado de celulasa completa comprende

(i) una o más beta-glucosidasas; y

(ii) una o más endoglucanasas y una o más celobiohidrolasas;

en donde la composición de alimentación inductora comprende soforosa en una concentración que se encuentra en el intervalo de 2 g/L a 25 g/L, y gentiobiosa en una concentración que se encuentra en el intervalo de 35 g/L a 60 g/L.

2. Un método para preparar una proteína codificada por un gen bajo el control de un promotor inducible por soforosa o un promotor inducible por gentiobiosa, comprendiendo el método: preparar una composición de alimentación inductora por el método según la reivindicación 1ª;

proporcionar un cultivo de células que comprenden dicho gen; y poner en contacto ducho cultivo de células con dicha composición de alimentación inductora en una cantidad efectiva para inducir la expresión de dicho gen.

3. El método según la reivindicación 2, en el que la proteína es una celulasa endógena.

4. El método según la reivindicación 2, en el que las células han sido transformadas con una construcción de expresión que comprende dicho promotor unido operativamente a dicho gen.

5. El método según la reivindicación 2, en el que el promotor es un promotor de xilanasa procedente de Trichoderma reesei o un promotor del gen de la celulasa.

6. El método según la reivindicación 5, en el que el promotor es el promotor cbh 1, cbh 2, eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 o xln2 de Trichoderma reesei.

7. El método según la reivindicación 4, en el que la proteína es una proteína heteróloga.

8. El método según la reivindicación 7, en el que la proteína heteróloga se elige entre el grupo que consiste en hormonas, enzimas, factores de crecimiento, citocinas y anticuerpos.

9. El método según la reivindicación 2, en el que la célula es un hongo filamentoso.

10. El método según la reivindicación 9, en el que el hongo se elige entre el grupo que consiste en Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Engothia, Mucor, Cochliobolus y Pyncularia.

11. El método según la reivindicación 10, en el que el hongo es Trichoderma reesei.

12. El método según la reivindicación 10, en el que el hongo es Penicillium funiculosum.

13. El método según la reivindicación 2, en el que la célula es una bacteria.

14. El método según la reivindicación 13, en el que la bacteria se elige entre el grupo que consiste en Streptomyces, Thermomonospora, Bacillus y Cellulomonas.

15. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el preparado de celulasa completa es de aproximadamente 2 g/L a aproximadamente 10 g/L de proteína.

16. El método según la reivindicación 15, en el que el preparado de celulasa completa es de aproximadamente 5 g/L de proteína.

17. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la solución se incuba durante un tiempo entre 8 horas y 500 horas.

18. El método según la reivindicación 17, en el que la solución se incuba durante un tiempo entre 48 horas y 72 horas.

19. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el preparado de celulasa completa es inmovilizado.

20. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el preparado de celulasa 10 completa contiene una beta-glucosidasa sobreexpresada en relación con el nivel nativo.

21. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 20, en el que dicha alimentación inductora se añade a dicho cultivo de células en el modo de lote alimentado.

22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21, en el que dicho cultivo de células se cultiva bajo condiciones de limitación de carbono.