Polinucleótido aislado, que codifica una proteína que tiene actividad de unión a celulosa y actividad catalítica de celulasa,

seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(e) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 3;

(f) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 3; y

(g) una secuencia de ácidos nucleicos presentada como SEC ID No. 2, o el complemento de la misma,

en el que el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, que incluyen una penalización por la abertura de espacio de 10,0, una penalización por la extensión del espacio de 0,1, y una matriz de similitud BLOSUM 30

Genes nuevos de Trichoderma.

Campo de la invención

Se describen en la presente invención cuatro genes - dos genes que codifican proteínas que comprenden un dominio de unión a celulosa, una arabinofuranosidasa, y una acetilxilano esterasa. También se describen aquí las proteínas deducidas, y las composiciones que tienen las nuevas proteínas. Estas composiciones son especialmente útiles en aplicaciones textiles, detergentes, conversión de biomasa, pienso y alimentos, y las industrias de la pulpa y el papel. Los genes se aislaron a partir de un hongo filamentoso, Trichoderma reesei (también denominado indistintamente aquí Hypocrea jecorina).

Antecedentes de la invención

La celulosa y la hemicelulosa son los materiales más abundantes de las plantas producidos por fotosíntesis. Se pueden degradar y utilizar como fuente de energía por numerosos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de la hidrólisis de los sustratos poliméricos a azúcares monoméricos (Aro et al., J. Biol. Chem., 10.1074/M003624200, 13 de abril de 2001). Dado que se acercan los límites de los recursos no renovables, el potencial de la celulosa para convertirse en una energía renovable principal es enorme (Krishna et al., Bioresource Tech. 77:193-196, 2001). La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos es una estrategia para superar la escasez de alimentos, pienso y combustibles (Ohmiya et al., Biotechnol. Gen. Engineer. Rev. 14:365-414, 1997).

La celulosa es un polisacárido lineal de residuos de glucosa conectados mediante uniones ß-1,4. En la naturaleza, la celulosa está normalmente asociada con lignina junto con hemicelulosas, tales como xilanos y glucomananos. El uso práctico de las celulasas está dificultado por la naturaleza de las celulasas conocidas, que a menudo son mezclas de celulasas que tienen una variedad actividades y especificidades de sustrato. Por esta razón, es deseable identificar celulasas que tienen sólo las actividades deseadas o proteínas que pueden facilitar la acción de la celulasa.

La hemicelulosa es cualquiera de los diversos heteropolímeros (polisacáridos en matriz) presentes en casi todas las paredes celulares junto con celulosa. Sus pesos moleculares son habitualmente inferiores a los de la celulosa y presentan una estructura no diferenciada débil en comparación con la celulosa cristalina. Las cadenas forman una "base" - se unen con pectina a la celulosa para formar un red de fibras reticuladas. De este modo, sería beneficioso aumentar la degradación de la hemicelulosa.

Las O-Glicosil hidrolasas (EC 3.2.1.-) con un grupo amplio de enzimas que hidrolizan el enlace glicosídico entre dos o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y un grupo no carbohidrato. EL sistema de clasificación para las glicosil hidrolasas, basada en la similitud de secuencias, ha conducido a la definición de hasta 60 familias diferentes [HENRISSAT, B. AND BAIROCH, A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. BIOCHEM. J. 293 781-788 (1993); HENRISSAT, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. BIOCHEM. J. 280 309-316 (1991); DAVIES, G. AND HENRISSAT, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. STRUCTURE 3 853-859 (1995); and HENRISSAT, B. AND BAIROCH, A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. BIOCHEM. J. 316 695-696 (1996)]. Las acetil xilano esterasas (EC 3.1.1.72) son un grupo de enzimas que eliminan grupos laterales acetilos a partir de xilano. El sistema de clasificación para carbohidrato esterasas, basado en la similitud de secuencias, ha conducido a la definición de 13 familias, siete de las cuales contienen acetil xilano esterasas (COUTINHO, P.M. AND HENRISSAT, B., 1999 Carbohydrate-active enzymes server at URL: <http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html>).

Con el fin de ser eficientes, la digestión de celulosa requiere de varios tipos de enzimas actuando de manera cooperativa. Son necesarias por lo menos tres categorías de enzimas para convertir la celulosa en glucosa: endo (1,4)-beta-D-glucanasas (EC 3.2.1.4) que cortan las cadenas de celulosa al azar; celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) que dividen las unidades de celobiosilo de los extremos de las cadenas de celulosa y beta-glucosidasas (EC 3.2.1.21) que convierten la celobiosa y las celodextrinas solubles en glucosa.

WO 95/16782 describe enzimas celulasa y sistemas para su expresión.

US 6,407,208 describe proteínas quiméricas que contienen un dominio de unión a celulosa situado entre dos proteínas deseadas independientes de diferentes longitudes.

WO 03/031477 describe proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión a carbohidrato y por lo menos un dominio de unión adicional capaz de unirse a (a) un ligando o sitio específico que forma parte de un organismo vivo, o (b) una microcápsula o micropartícula.

WO 01/46357 describe proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión a celulosa y un dominio que tiene una afinidad de unión elevada por otro ligando.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas mejoradas que tienen una actividad degradante de celulosa o hemicelulosa y polinucleótidos que codifican las proteínas. Un objetivo de la presente invención es proporcionar proteínas mejoradas que tienen actividad de unión a celulosa o hemicelulosa y polinucleótidos que codifican las proteínas.

Las proteínas mejoradas pueden mejorar la degradación del material de la pared celular, por ejemplo, celulosa y/o hemicelulosa. Las proteínas también pueden mejorar la estabilidad o la actividad de otras enzimas implicadas en la degradación del material de la pared celular de la planta, por ejemplo, biomasa.

Descripción resumida de la invención

Se proporcionan aquí genes nuevos, denominados aquí cip1, cip2, axe2 y abf2. También se proporcionan aquí los productos génicos codificados por los genes nuevos. Por lo menos dos genes se coexpresan con los genes en la familia de celulasa.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1. El polinucleótido puede ser ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico o un análogo no codificante de los mismos. En una realización específica, el polinucleótido comprende una secuencia sustancialmente idéntica a la SEC ID No. 1.

En un Segundo aspecto, los polipéptidos CIP1 son tal como se definen en las reivindicaciones.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos, que codifica el polipéptido de la presente invención, unida operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la invención.

La presente invención proporciona además vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica CIP1 tal como se define en las reivindicaciones unida operativamente a elementos reguladores eficaces para la expresión de la proteína en un huésped seleccionado. En un aspecto relacionado, la presente invención incluye una célula huésped que contiene el vector.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante transformada con el vector de la invención.

La presente invención incluye además un método para producir CIP1 tal como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición enzimática útil en la conversión de celulosa a etanol. La composición enzimática comprende CIP1 tal como se define en las reivindicaciones. La composición puede comprender además las enzimas celulasa o hemicelulosa adicionales, tales como endoglucanasas y/o celobiohidrolasas y/o xilanasas y similares. La composición se puede enriquecer en CIP1.

También se describen aquí métodos analíticos para detectar ácidos nucleicos cip1 y proteínas CIP1.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación en cadena sencilla de la secuencia de ácidos nucleicos...

1. Polinucleótido aislado, que codifica una proteína que tiene actividad de unión a celulosa y actividad catalítica de celulasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(d) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(e) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 3;

(f) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido CIP1 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 3; y

(g) una secuencia de ácidos nucleicos presentada como SEC ID No. 2, o el complemento de la misma,

en el que el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, operado con los parámetros por defecto, que incluyen una penalización por la abertura de espacio de 10,0, una penalización por la extensión del espacio de 0,1, y una matriz de similitud BLOSUM 30.

2. Polinucleótido aislado que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 3.

3. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho polinucleótido es una molécula de ARN.

4. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la enzima deriva de una fuente de Trichoderma.

5. Polinucleótido aislado según la reivindicación 4, en el que la enzima deriva de Trichoderma reesei.

6. Construcción de expresión que comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

7. Vector que comprende la construcción de expresión de la reivindicación 6.

8. Vector que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

9. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 7 o la reivindicación 8.

10. Célula huésped según la reivindicación 9, que es una célula procariota.

11. Célula huésped según la reivindicación 9, que es una célula eucariota.

12. Polipéptido CIP1 aislado con la actividad biológica de una proteína de unión a celulosa y que tiene actividad catalítica de celulasa, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(c) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 5;

(d) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 5;

(e) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 3;

(f) una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 3; y

(g) un fragmento sustancialmente purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 5, donde el fragmento comprende por lo menos 200 aminoácidos.

13. Polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID No. 3.

14. Método de producción de una enzima que tiene actividad de unión a celulosa y actividad catalítica de celulasa, que comprende:

(a) cultivar la célula huésped según la reivindicación 9 en condiciones adecuadas para dicha célula huésped para producir dicha enzima; y

(b) recuperar dicha enzima.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso o una célula de levadura.

16. Método de producción de una célula huésped recombinante, que comprende introducir una deleción o inserción u otra alteración en un gen cip1 de una célula que comprende dicho gen cip1 para desactivar el gen cip1 y evitar la producción de un polipéptido CIP1, donde el polipéptido CIP1 es tal como se define en la reivindicación 12, y donde el gen cip1 comprende un polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

17. Oligonucleótido antisentido complementario a un ARN mensajero que codifica un polipéptido CIP1 que tiene la secuencia presentada como SEC ID No. 5, donde tras la exposición a una célula huésped productora de CIP-1, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de CIP1 por dicha célula huésped.

18. Oligonucleótido antisentido según la reivindicación 17, donde la célula huésped es un hongo filamentoso.

19. Composición de detergente que comprende un polipéptido CIP1 tal como se define en la reivindicación 12 o la reivindicación 13.

20. Aditivo alimentario que comprende un polipéptido CIP1 tal como se define en la reivindicación 12 o la reivindicación 13.

21. Método de tratamiento de la pulpa de la madera que comprender poner en contacto dicha pulpa de la madera con un polipéptido CIP1 tal como se define en la reivindicación 12 o la reivindicación 13.

22. Método de convertir biomasa en azúcares que comprende poner en contacto dicha biomasa con un polipéptido CIP1 tal como se define en la reivindicación 12 o la reivindicación 13.