GLUCOAMILASA DE TRICHODERMA REESEI Y HOMÓLOGOS DE LA MISMA.

Glucoamilasa de Trichoderma reesei y homólogos de la misma CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se refiere a composiciones de nuevas enzimas que comprenden una glucoamilasa y una alfa amilasa útiles para la producción de glucosa y otros productos finales a partir de almidón. Las composiciones de enzimas son adecuadas para utilizar en varios procesos y son particularmente adecuadas para utilizar bajo condiciones de procesamiento convencional de almidón a alta temperatura y bajo condiciones de procesamiento de almidón sin cocción o baja temperatura. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Las enzimas de glucoamilasa (-1,4-glucano glucohidrolasas, E.C.3.2.1.3.) son carbohidrasas que hidrolizan el almidón que actúan de forma exógena. Las glucoamilasas catalizan la eliminación de unidades sucesivas de glucosa desde los extremos no reductores de almidón u oligomoléculas y polisacáridos relacionados y pueden hidrolizar enlaces glicosídicos tanto lineales como ramificados de almidón (amilasa y amilopectina). [0003] Las glucoamilasas son producidas por numerosas cepas de bacterias, hongos, levadura y plantas. Las glucoamilasas particularmente interesantes son enzimas fúngicas que son producidas extracelularmente, por ejemplo, de cepas de Aspergillus (Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; Hayashida et al (1989) Agric. Biol. Chem. 53:923 - 929; USP 5,024,941; USP 4,794,175; y WO 88/09795), Talaromyces (USP 4,247,637; USP 6,255,084 y USP 6,620,924), Rhizopus (Ashikari et al. (1986) Agric. Biol. Chem. 50:957 - 964; Ashikari et al. (1989) App. Microbiol. and Biotech. 32:129 - 133 y USP 4,863,864), Humicola (WO05/052148 y USP 4,618,579) y Mucor (Houghton-Larsen et al., (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol., 62: 210- 217). Muchos de los genes que codifican estas enzimas se han clonado y expresado en células de levadura y fúngicas. [0004] Las glucoamilasas comerciales son enzimas muy importantes que se han utilizado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón. Las glucoamilasas se utilizan para la hidrólisis de almidón para producir edulcorantes de maíz con alto contenido de fructosa, y edulcorantes de maíz que comprenden por encima del 50% del mercado de edulcorantes de Estados Unidos. En general, los procesos que hidrolizan el almidón implican la utilización de alfa amilasas para hidrolizar el almidón en dextrinas y las glucoamilasas para hidrolizar las dextrinas a glucosa. A continuación, la glucosa se convierte en fructosa mediante otras enzimas, tales como glucosas isomerasas. La glucosa producida por glucoamilasas también se puede cristalizar o utilizar en fermentaciones para producir otros productos finales, tales como ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glutámico, 1,3propanodiol y otros. Las glucoamilasas se utilizan en la producción de alcohol, tal como la producción de cerveza y la producción de sake. Las glucoamilasas también se utilizan en la producción de etanol para combustible y para el consumo. Recientemente, se han utilizado las glucoamilasas en procesos a baja temperatura para la hidrólisis de almidón granular (no cocinado). Las glucoamilasas también se utilizan en la preparación de alimentos de animales como aditivos alimenticios o como componentes de alimentos líquidos para animales de ganado. [0005] Aunque las glucoamilasas se han utilizado de manera satisfactoria durante mucho tiempo, aún existe la necesidad de nuevas glucoamilasas útiles. La presente invención se basa en el descubrimiento de composiciones de nuevas enzimas adecuadas para utilizar en varias aplicaciones y particularmente procesos de conversión de almidón. DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0006] La presente invención proporciona composiciones de enzimas y métodos de utilización de dichas composiciones de enzimas, tal como se define en las reivindicaciones. [0007] La presente invención se refiere a una enzima que tiene actividad de glucoamilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4 o secuencias sustancialmente homólogas a la misma y variantes alélicas y fragmentos biológicamente funcionales de las mismas. [0008] En otra realización, la presente invención se refiere a procesos de conversión de almidón que utilizan preparaciones de enzimas de la invención. En algunas realizaciones, la composición se puede utilizar en un proceso de conversión de almidón o almidón parcialmente utilizado en un jarabe que contiene dextrosa. La composición se puede utilizar en un proceso para producir jarabes especializados. En realizaciones adicionales, la composición se puede utilizar en una fermentación para producir productos finales, tales como alcoholes y particularmente etanol. 2   BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0009] Las figuras 1A - B muestran secuencia de ADN genómico (SEC ID NO: 1) que codifican la glucoamilasa de Trichoderma reesei de la figura 3. Las figuras 2A - B muestran la secuencia de ADN sin intrones (SEC ID NO: 2) que codifica la glucoamilasa de Trichoderma reesei de la figura 3. La figura 3A muestra la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO: 3) de la glucoamilasa de Trichoderma reesei que tiene 632 aminoácidos, donde la secuencia señal (SEC ID NO: 38) está en negrita y está representada por las posiciones de residuos 1 - 20; la prosecuencia (SEC ID NO: 39) está en negrita y subrayada y representada por las posiciones de residuos 21 - 33; el dominio catalítico (SEC ID NO: 40) está representada por las posiciones de residuos 34 - 486; la región adaptadora (SEC ID NO: 41) está en cursiva y representada por las posiciones de residuos 487 - 523; y el dominio de unión a almidón (SEC ID NO: 42) está en cursiva y subrayada y representada por las posiciones de residuos 524 - 632. El residuo de aminoácido N-terminal de la proteína madura representada por la posición de residuo 34 es serina. La figura 3B muestra la secuencia de proteína madura deducida (SEC ID NO: 4) de la glucoamilasa de Trichoderma reesei de la figura 3A. La secuencia de la proteína madura incluye el dominio catalítico, que está subrayado (SEC ID NO: 40), la región adaptadora (SEC ID NO: 41) y el dominio de unión a almidón (SEC ID NO: 42). La figura 4 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2154 pb (SEC ID NO: 5) que codifica la glucoamilasa de Hypocrea citrina var. americana (GA102) (SEC ID. NO: 6). La figura 5 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2152 pb (SEC ID NO: 7) que codifica la glucoamilasa de Hypocrea vinosa (GA104) (SEC ID NO: 8). La figura 6 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2158 pb (SEC ID NO: 9) que codifica una glucoamilasa de Trichoderma sp. (GA105) (SEC ID NO: 10). La figura 7 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2144 pb (SEC ID NO: 11) que codifica una glucoamilasa de Hypocrea gelatinosa (GA107) (SEC ID NO: 12). La figura 8 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2127 pb (SEC ID NO: 13) que codifica una glucoamilasa de Hypocrea orientalis (GA108) (SEC ID NO: 14). La figura 9 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2139 pb (SEC ID NO: 15) que codifica una glucoamilasa de Trichoderma konilangbra (GA109) (SEC ID NO: 16). La figura 10 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2088 pb (SEC ID NO: 28) que codifica una glucoamilasa de Trichoderma sp. (GA113) (SEC ID NO: 29). La figura 11 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2141 pb (SEC ID NO: 30) que codifica una glucoamilasa de Trichoderma harzianum (GA103) (SEC ID NO: 31). La figura 12 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2131 pb (SEC ID NO: 32) que codifica una glucoamilasa de Trichoderma longibrachiatum (GA124) (SEC ID NO: 33). La figura 13 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2151pb (SEC ID NO: 34) que codifica una glucoamilasa de Trichoderma asperellum (GA127) (SEC ID NO: 35). La figura 14 muestra la secuencia de ADN genómico que tiene 2142 pb (SEC ID NO: 36) que codifica una glucoamilasa de Trichoderma strictipilis (GA128) (SEC ID NO: 37). La figura 15A - I muestra las posibles secuencias de aminoácidos para las glucoamilasas codificadas por las secuencias de ADN de SEC ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 28, 30, 32, 34 y 36, que corresponden a las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 29, 31, 33, 35 y 37 respectivamente, donde el péptido líder está en negrita y la prosecuencia está subrayada y en negrita para cada proteína. La secuencia de la proteína madura que excluye la secuencia líder y prosecuencia para cada proteína también está representada como la SEC ID NO: 17 para (1) GA102; SEC ID NO: 18 para (2) GA104; SEC ID NO: 19 para (3) GA105; SEC ID NO: 20 para (4) GA107; SEC ID NO: 21 para (5) GA108; SEC ID NO: 22 para (6) GA109; SEC ID NO: 43 para (7) GA113; SEC ID 3   NO: 44 para (8) GA103; SEC ID NO: 45 para (9) GA124; SEC ID NO: 46 para (10) GA127 y SEC ID NO: 47 para (11) GA128. La figura 16 ilustra el gel SDS-PAGE... [Seguir leyendo]

1. Composición de enzimas que comprende una glucoamilasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica por lo menos en un 90% con la SEC ID NO: 4 y una alfa amilasa de Aspergillus, en la que la alfa amilasa tiene por lo menos un 90% de identidad con la secuencia de proteína madura de la SEC ID NO: 27, y en la que la actividad específica de dicha glucoamilasa es por lo menos un 90% de la actividad específica de una glucoamilasa que tiene la secuencia de SEC ID NO: 4. 2. Composición de enzimas según la reivindicación 1, en la que la glucoamilasa tiene una identidad de secuencia de por lo menos un 95% ó un 97% con la SEC ID NO: 4. 3. Composición de enzimas según la reivindicación 1, en la que la alfa amilasa tiene por lo menos un 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad con la secuencia de proteína madura de SEC ID NO: 27. 4. Método de hidrolización de almidón que comprende tratar un sustrato que contiene almidón con una composición de enzimas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5. Método para producir un producto de fermentación a partir de un sustrato que contiene almidón granular que comprende a) poner en contacto un sustrato que contiene almidón granular con una composición de enzimas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización, a un pH de aproximadamente 4 a 7,0 durante un periodo de tiempo para producir una composición que comprende glucosa, y b) poner en contacto la glucosa con un organismo de fermentación bajo condiciones de fermentación adecuadas para producir un producto de fermentación. 6. Método según la reivindicación 5, en el que el producto de fermentación es etanol. 7. Método para sacarificar almidón licuado que comprende tratar almidón licuado con una composición de enzimas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y obtener una composición que incluye por lo menos un 80% de glucosa. 22   Figura 1A-B Secuencia de ADNg de Trichoderma reesei (Sec ID No: 1) 23   Figura 2A-B Secuencia de ADNc de Trichoderma reesei (Sec ID No: 2) 24   Figura 3A Secuencia de aminoácidos de TrGA (SEC ID No: 3)   Figura 3B proteína madura TrGA (SEC ID No: 4) 26   Figura 4A-B Secuencia de ADNg de Hypocrea citrina var. Americana, (GA102) 2154 pb (SEC ID No: 5) 27   Figura 5A-B Secuencia de ADNg de Hypocrea vinosa, (GA104) 2152 pb (SEC ID No: 7) 28   Figura 6A-B Secuencia de ADNg de Trichoderma sp., (GA105) 2158 pb (SEC ID No: 9) 29   Figura 7A-B Secuencia de ADNg de Hyprocrea gelatinosa, (GA107) 2144 pb (SEC ID No: 11)   Figura 8A-B Secuencia de ADNg de Hyprocrea orientalis, (GA108) 2127 pb (SEC ID No: 13) 31   Figura 9A-B Secuencia de ADNg de Trichoderma konilangbra, (GA109) 2139 pb (SEC ID No: 15) 32   Figura 10A-B Secuencia de ADNg de Trichoderma sp., (GA113) 2088 pb (SEC ID No: 28) 33   Figura 11A-B Secuencia de ADNg de Trichoderma harzianum, (GA103) 2141 pb (SEC ID No: 30) 34   Figura 12A-B Secuencia de ADNg de Trichoderma longibrachiatum, (GA124) 2131 pb (SEC ID No: 32)   Figura 13A-B Secuencia de ADNg de Trichoderma asperellum, (GA127) 2151 pb (SEC ID No: 34) 36   Figura 14A-B Secuencia de ADNg de Trichoderma strictipilis, (GA128) 2142 pb (SEC ID No: 36) 37   Figura 15A-I a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Hypocrea citrina var. americana (CBS976.69), (GA102) que tiene 632 aminoácidos (SEC ID No: 6), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 632 (SEC Id No: 17) 1b) Secuencia de la proteína madura para GA102 (SEC ID No: 17) 2a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Hypocrea vinosa (CBS960.68), (GA104) que tiene 631 aminoácidos (SEC ID No: 8), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 631 (SEC Id No: 18) 38   1b) Secuencia de la proteína madura para GA104 (SEC ID No: 18) 3a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Trichoderma sp. (GA105) que tiene 633 aminoácidos (SEC ID No: 10), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 633 (SEC Id No: 19) 39   3b) Secuencia de la proteína madura para GA105 (SEC ID No: 19) 4) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Hyprocrea gelatinosa (CBS254.62) (GA107) que tiene 631 aminoácidos (SEC ID No: 12), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 631 (SEC Id No: 20) 4b) Secuencia de la proteína madura para GA107 (SEC ID No: 20)   5a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Hyprocrea orientalis (ATCC90550) (GA108) que tiene 632 aminoácidos (SEC ID No: 14), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 632 (SEC Id No: 21) 5b) Secuencia de la proteína madura para GA108 (SEC ID No: 21) 6a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Trichoderma konilangbra (GA109) que tiene 632 aminoácidos (SEC ID No: 16), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 632 (SEC Id No: 22) 41   6b) Secuencia de la proteína madura para GA109 (SEC ID No: 22) 7a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Trichoderma sp. (DAOM177690) (GA113) que tiene 627 aminoácidos (SEC ID No: 29), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 31 627 (SEC Id No: 43) 42   7b) Secuencia de la proteína madura para GA113 (SEC ID No: 43) 8a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Trichoderma harzianum (CBS433.95) (GA103) que tiene 631 aminoácidos (SEC ID No: 31), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 631 (SEC Id No: 44) 8b) Secuencia de la proteína madura para GA103 (SEC ID No: 44) 43   9a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Trichoderma longibrachiatum (IMI92.027) (GA124) que tiene 632 aminoácidos (SEC ID No: 33), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 632 (SEC Id No: 45) 9b) Secuencia de la proteína madura para GA124 (SEC ID No: 45) 10a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Trichoderma asperellum (ATCC28020) (GA127) que tiene 631 aminoácidos (SEC ID No: 35), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 631 (SEC Id No: 46) 44   10b) Secuencia de la proteína madura para GA127 (SEC ID No: 46) 11a) Posible secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa de Trichoderma strictipilis (CBS347.93) (GA128) que tiene 632 aminoácidos (SEC ID No: 37), en la que la secuencia de la proteína madura está representada por las posiciones de los residuos de aminoácidos 34 632 (SEC Id No: 47) 11b) Secuencia de la proteína madura para GA128 (SEC ID No: 47)   46   Figura 16. Gel SDS-PAGE utilizado para determinar el PM de la TrGA purificada 47   Figura 17A Mapa del plásmido del vector de expresión pTrex3g de T. Reesei Figura 17B Mapa del plásmido que incluye el vector de expresión pNSP23 de T. Reesei, el gen de GA de T. Reesei clonado en pTRex3g 48   Figura 18 Actividad relativa % Actividad relativa % Actividad de GA TrGA a 37 o C Actividad de GA TrGA a pH 4 Temperatura 49   Figura 19 Carril 1: GA104 Carril 2: GA105 Carril 3: GA107 Carril 4: GA109 Carril 5: TrGA Carril 6: Huésped T. reesei Carril 7: Marcador PM   Figura 20 A. Secuencia de aminoácidos de glucoamilasa de Aspergillus Níger (SEC Id No: 26) que incluye la secuencia señal B. B. Secuencia de aminoácidos de glucoamilasa de alfa amilasa de Aspergillus kawachi (AkAA) (SEC Id No: 27) que incluye la secuencia señal C. 51