Polipéptidos derivados de la proteína PSAP (Psesenilin 1-Associated Protein) capaces de inducir apoptosis y usos de los mismos.

La presente invención se refiere a polipéptidos derivados de la PSAP, a los polinucleótidos codificantes de dichos polipéptidos y, más concretamente, al uso de éstos en el tratamiento de enfermedades, preferentemente cáncer

Polipéptidos derivados de la proteína PSAP (presenilin 1-associated protein) capaces de inducir apoptosis y usos de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos derivados de la PSAP, a los polinucleótidos codificantes de dichos polipéptidos y, más concretamente, al uso de éstos en el tratamiento de enfermedades, preferentemente cáncer.

Estado de la técnica

La apoptosis es un tipo de muerte celular programada necesaria para el correcto desarrollo de los organismos multicelulares, así como para la eliminación de células dañadas. Los mecanismos o rutas a través de los cuales se activan los procesos de muerte celular, que se conocen hasta la fecha, son básicamente dos: la ruta extrínseca activada por la unión de determinados receptores de membrana a ligando y la ruta intrínseca en la que en la membrana externa mitocondrial se forman poros o se rompe, liberándose así determinadas proteínas del espacio intermembrana de la mitocondria, que pueden activar los mecanismos de apoptosis.

La despolarización de las mitocondrias tiene lugar a través de la apertura del poro de transición de la permeabilidad ("permeability transition pore" PTP). Sin embargo la composición de este poro es aun desconocida y, únicamente, se conocen algunos de sus componentes como son ANT ("inner membrane adenine nucleotide translocator"), VDAC ("outer membrane voltage dependent anion channel") o la ciclofilina D ("cyclophilin D"), junto con otras proteínas que pueden no estar siempre presentes en el poro, aunque algunas de las proteínas mismas se ha demostrado que no son necesarias para la transición de permeabilidad.

Por otro lado, también se ha descrito que algunos miembros proapoptóticos y anti-apoptóticos de la familia de Bcl-2 son capaces de interaccionar con PTP e, incluso, que existen otros canales como el recientemente descrito MAC ("mitochondrial apoptosis-induced channel"), que también participan en los procesos de muerte celular programada.

En los últimos años se ha observado también que otras proteínas como PSAP ("presenilin 1-associated protein") o mtch1 ("mitochondrial carrier homolog 1"), una proteína mitocondrial que interacciona con la presenilina 1, induce el proceso de muerte celular por apoptosis cuando sus niveles intracelulares son aumentados por sobreexpresión de la misma en células en cultivo. Estos y otros datos sugieren que PSAP está relacionada con la muerte celular apoptótica y que podría jugar un papel importante en diversas enfermedades degenerativas, tales como el Alzheimer, así como en diversos tipos de cánceres.

Sin embargo hasta la fecha, la poca información disponible en relación con PSAP y sus diferentes isoformas, el desconocimiento de su estructura ó la dificultad que entraña su expresión al desencadenar los procesos de apoptosis, ha impedido desarrollar potenciales fármacos o moléculas que modulen su actividad.

Breve descripción de la invención

Los autores de la presente invención han conseguido determinar que la actividad de PSAP no depende únicamente de un dominio proapoptótico, sino que PSAP posee dos dominios capaces de inducir la muerte celular de forma independiente (posiciones de 65-112; en adelante Apo I: SEQ ID NO:2; y posiciones 113-168; en adelante Apo II: SEQ ID NO:3) de la isoforma larga (SEQ ID NO:8).

Otro de los hechos relevantes de la invención lo constituye que un dominio conservado en transportadores de la membrana interna mitocondrial presente en PSAP entre las posiciones 206 a 266 (MCD, "mitocondrial carrier domain"), que en principio se consideró que podía ser fundamental para que la proteína desempeñase su función, ha sido finalmente descartado, al comprobarse que cuando éste era delecionado PSAP mantenía su actividad apoptótica. Esta circunstancia permite reducir el número de posibles dianas para los procesos de desarrollo de potenciales fármacos moduladores de la actividad de PSAP.

No menos sorprendente ha sido descubrir que aun cuando Apo I o Apo II son necesarios para la actividad apoptótica de PSAP, cuando ambos dominios se expresan independientemente en células, junto con un dominio de localización e inserción en la membrana externa mitocondrial (dominio transmembrana de la proteína Bcl-XL), son capaces de inducir la apoptosis.

Descripción de las figuras

Figura 1. A) Imagen de microscopía de fluorescencia. Núcleos apoptóticos de células sobreexpresando ambas isoformas de PSAP. Los paneles izquierdos muestran células HeLa expresando EGFP y lo derechos se corresponden con las mismas células observadas con filtro azul-violeta para mostrar los núcleos teñidos con Hoechst 33342. Los paneles A y B, células expresando PSAPL-EGFP; C y D, células expresando PSAPS-DN64-EGFP; E y F, células expresando GB-EGFP, empleado como control. B) Western blot para determinar el corte de PARP (panel superior) en células HEK293 transfectadas con vectores que codifican PSAPL-EGFP (L; 69 KDa) y PSAPS-EGFP (S; 67,4 KDa). El panel inferior muestra la detección de proteínas con anticuerpos anti-GFP para determinar los niveles de expresión. GB indica EGFP fusionada con la secuencia de direccionamiento a mitocondrias de pol gB (35,6 Kda), utilizado como control positivo del direccionamiento a mitocondrias.

Figura 2. Western blots (A y B) de células HEK293 transfectadas para determinar la inducción de apoptosis por los mutantes de deleción construidos, mediante la determinación del corte de PARP. GB, secuencia de direccionamiento a mitocondrias de Xenopus pol gamma B fusionado a EGPF (35,6 Kda). Los nombres de los mutantes se han abreviado eliminando PSAP respecto a los nombres mostrados en la figura 3.

Figura 3. Esquema de los diferentes mutantes de deleción utilizados en las transfecciones. Mito indica la presencia (+) o no (-) del mutante en la mitocondria y Apo la inducción (+) o no (-) de apoptosis.

Figura 4. Imágenes de microscopía confocal de células HeLa expresando PSAPL (L), PSAPS (S) y diferentes mutantes de deleción. Los paneles de la izquierda muestran la EGFP en verde; los del centro, el Mitotracker red en rojo; y los de la derecha el solapamiento de los dos anteriores (amarillo cuando existe colocalización de verde y rojo). N112, N168, TM1, Loop, TM2, C51, I y MCD, se corresponden con mutantes de deleción de PSAPL, para los que se han delecionado respectivamente las siguientes regiones, 1-112, 1-168, 253-275, 278-313, 316-338, 339-389, 169-252 y 206-266. GB, secuencia de direccionamiento a mitocondrias de Xenopus pol gamma B fusionada a EGPF (35,6 Kda). GFP, proteína EGFP como control.

Figura 5. Western blots mostrando que PSAPL recombinante se localiza en la membrana externa mitocondrial (A) y que PSAPLDTMI se asocia con la mitocondria pero no se integra en la membrana, al contrario que PSAPL, que sí lo hace (B). En (A) Se usaron células HEK293 transfectadas, dividiendo la preparación de mitocondrias en varias alícuotas que se trataron (+) o no (-) con proteasa K, digitonina 0,04% (4) 6 0,12% (12) y Tritón X-100. Se analizaron marcadores de los distintos compartimentos mitocondriales, Tom20 (membrana externa), Cyt c (espacio intermembranas), Cox-1 (membrana interna) y HSP60 (matriz). En (B) se sometieron las mitocondrias a extracción con carbonato sódico a pH básico y se separaron luego una fracción insoluble (P) y otra soluble (S) a partir de las mitocondrias iniciales (M).

Figura 6. Imágenes de microscopía confocal realizada con células HeL transfectadas con GB, TM1, TMP2 o TMP3 (PSAP se ha eliminado del nombre de estos tres últimos para abreviar). Los paneles izquierdos muestran EGFP en verde; los centrales, Tom20 en rojo; y los derechos, el solapamiento de los dos anteriores.

Figura 7. Western blots mostrando que TMP2 es incapaz de inducir apoptosis, al contrario que TMP3 (A; corte de PARP). Aunque TMP2 se asocia con la mitocondria, no se integra en la membrana (B; extracción con carbonato sódico a pH básico. M, P y S, como en la Figura 5B).

Figura 8. Localización mitocondrial e inducción de apoptosis de los mutantes DAPO, DAPO2 y DAPO3. (A) Microscopía confocal como en las figuras 4 y 6. (B) Western blot para detectar el corte de PARP y la expresión de los mutantes como en las figuras 2 y 7A.

Figura 9. Actividad apoptótica de las regiones 65-168, 65-112 y 113-168 dirigidas a la mitocondria mediante fusión al dominio transmembrana de Bcl-XL. El panel superior muestra el corte de PARP, incluyendo un control positivo (PSAPL-EGFP) y uno negativo (GB-EGFP)....

1. Polipéptido aislado para la elaboración de un medicamento, cuya secuencia es seleccionada del grupo que comprende:

2. Polipéptido asilado según la reivindicación anterior donde la homología es de al menos el 90%.

3. Polipéptido asilado, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde los fragmentos de SEQ ID NO:1 son seleccionados del grupo que comprende:

4. Polipéptido aislado, según cualquiera de las reivindicaciones, anteriores caracterizados porque además comprenden un dominio de direccionamiento a mitocondrias fusionado.

5. Polipéptido asilado, según la reivindicación anterior, caracterizado porque el dominio de direccionamiento a mitocondrias comprende cualquiera de las secuencias seleccionada del grupo que comprende:

6. Polipéptido aislado, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

7. Polinucleótido aislado para la elaboración de un medicamento, donde dicho polinucleótido es capaz de codificar para cualquiera de los polipéptidos de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación anterior.

9. Uso de un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la identificación de moléculas capaces de interaccionar con el mismo y modular la actividad de la proteína PSAP.