IF-1 y mutantes del mismo para su uso como medicamento.La presente invención se refiere al uso como medicamento,

preferentemente para el tratamiento del cáncer, de un polinucleótido, que codifica para la proteína IF-1, una versión mutante de ésta (H49K) y homólogos de las mismas capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales, preferentemente dependientes de la actividad ATP-asa de la mitocondria

IF-1 y mutantes del mismo para su uso como medicamento.

La presente invención se refiere al uso como medicamento, preferentemente para el tratamiento del cáncer, de un polinucleótido, que codifica para la proteína IF-1, una versión mutante de ésta (H49K) y homólogos de las mismas capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales, preferentemente dependientes de la actividad ATP-asa de la mitocondria.

Estado de la técnica anterior

Las mitocondrias desarrollan un papel fundamental en el suministro de energía metabólica al sintetizar el ATP celular. La ATP sintasa (ATPasa) es el complejo enzimático de la membrana interna de la mitocondria que lleva a cabo la síntesis de ATP utilizando para ello el gradiente electroquímico de protones generado por la actividad de la cadena respiratoria. Pullman y Monroy (Pullman M.E. and Monroy G.C. (1963) J Biol Chem 238:3762-9) descubrieron una proteína (IF-1) que inhibía la actividad hidrolasa de la ATP sintasa a valores bajos de pH ((Green, D.W., and Grover, G.J. Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1458: 343-355 (2000)).

Posteriormente, se detectó que la versión mutante de IF-1 denominada como H49K (Richard Schinicer et al, Biochem. Biophys. Acta (1996) vol. 1292: 241-249) era capaz de unirse a la ATPasa independientemente del pH de la mitocondria e inhibir la actividad de su diana (Cabezón, E. et al.,(2000) Modulation of the oligomerization state ofthe bovine F1-ATPase inhibitor protein, IF-1, by pH. J. Biol. Chem. 275(33):25460-4).

En años posteriores se observó que se producía una represión específica de la expresión de la subunidad β de la ATP sintasa en biopsias de pacientes con cáncer de hígado, colon, pulmón, riñón, mama, estómago y esófago (Cuezva, J.M et al. (2002). The bioenergetic signature of cancer: a marker of tumor progression. Cancer Res; 62 (22): 6674-6681; Cuezva, J.M et al., (2004). The bioenergetic signature of lung adenocarcinomas is a molecular marker of cancer diagnosis y prognosis. Carcinogenesis, 25, 1157-1163; Isidoro, A et al., (2004). Alteration of the bioenergetic phenotype of mitochondria is a hallmark of breast, gastric, lung and esophageal cancer. Biochem. J; 378 (Pt 1): 17-20; Isidoro A et al., (2005) Breast carcinomas fulfill the Warburg hypothesis and provide metabolic markers of cancer prognosis. Carcinogenesis; 26:2095-104), lo que indicaba que a medida que un tumor se hacía más agresivo la ATP-asa disminuía su expresión en los tejidos tumorales. Estos datos sugerían la posible implicación del fenotipo bioenergético de la mitocondria en los procesos de carcinogénesis y que la inhibición de IF-1 en células tumorales podía originar tumores agresivos o altamente proliferativos.

Explicación de la invención

Los autores de la presente invención han tratado de desarrollar una metodología que permitiera la interferencia con la función bioenergética de la mitocondria a nivel molecular, con el objetivo de obtener tumores agresivos y así conocer mejor la implicación de la mitocondria en los proceso tumorales. Persiguiendo este objetivo, se han llevado a cabo diferentes experimentos de inhibición de la ATP-sintasa, que sorprendentemente han resultado en una inhibición del crecimiento células tumorales, cuando lo esperado habría sido obtener células tumorales altamente proliferativas.

Inicialmente, se han realizado estudios sobre el efecto de la sobre-expresión del inhibidor fisiológico de la ATP sintasa (IF-1) y una forma mutante del mismo (H49K) en dos líneas celulares: NRK (normal) y HepG2 (tumoral), con objeto de determinar la implicación de la fosforilación oxidativa en la progresión tumoral. Para ello, se ha generado y clonado IF-1 (SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:5) y el mutante de IF-1, conocido como H49K (SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:7-8), el cual para su correcto procesado en el interior celular fue transfectado en su forma precursora también mutada (SEQ ID NO:4 -en esta secuencia la mutación se encuentra en la posición 74, aunque a lo largo de la descripción nos referimos a ella como H49K; SEQ ID NO:9-10). Los experimentos han demostrado que en las líneas celulares estudiadas, dependientes de la fosforilación oxidativa, la sobre-expresión de IF-1 y H49K en transfección transitoria produce un aumento del flujo glucolítico en ambas líneas, lo que indica una interferencia de IF-1 y H49K con la ATP sintasa y, por tanto, con la provisión de energía metabólica por fosforilación oxidativa.

Sin embargo, sorprendentemente, se ha observado que la sobre-expresión de IF-1 y H49K tiene un efecto diferencial en el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) que es dependiente del tipo celular estudiado. Concretamente, en células NRK la expresión de IF-1 o H49K promueve un aumento de ΔΨm que coincide con un aumento de la proliferación celular en ausencia de cambios significativos en la producción de ROS (radicales libres de oxigeno) y, por el contrario, en células HepG2 la expresión de IF-1 o H49K promueve la disminución de ΔΨm que coincide con una disminución de la proliferación celular y de la producción de ROS.

Así, un primer aspecto de la presente invención está referido al uso como medicamento, preferentemente para el tratamiento del cáncer, de un polinucleótido capaz de codificar para un polipéptido con al menos un 40% de homología con la secuencia polipeptídica de la proteína IF-1, mutantes de IF-1 o precursores de los mismos, donde dicho polipéptido es capaz de inhibir el crecimiento de células tumorales, preferentemente dependientes de la actividad ATP-asa de la mitocondria. En realizaciones sucesivamente más preferidas de este aspecto de la invención el polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene una homología de al menos el 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 98% con la proteína IF-1, mutantes de la misma o precursores de los mismos. En una realización aun más preferida, el mutante de IF-1 tiene al menos la sustitución H49K (mutante H49K). Y en una realización todavía más preferida los polinucleótidos, que codifican para polipéptidos homólogos al mutante H49K o precursores del mismo, mantienen la sustitución H49K. En adelante este polinucleótido será denominado como "polinucleótido de la invención".

En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención el polinucleótido de la invención codifica para un polipéptido que tiene al menos un 40% de homología, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 98%, con la proteína IF-1 o precursores de la misma (polipéptidos homólogos a IF-1), cuya secuencia comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del siguiente grupo o variantes alélicas de las mismas:

En una realización todavía aun más preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido de la invención, que codifica para los polipéptidos homólogos a IF-1, comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del siguiente grupo o variantes alélicas de las mismas:

donde R' es un polinucleótido de direccionamiento a mitocondrias y R'' es una secuencia de terminación de la transcripción.

En una realización también más preferida de este aspecto de la invención el polinucleótido de la invención codifica para un polipéptido que tiene al menos un 40% de homología, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 98%, con el mutante H49K o precursores del mismo (polipéptidos homólogos al mutante H49K), cuya secuencia comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del siguiente grupo o variantes alélicas de las mismas: