Isoformas de PSAP, determinantes antigénicos, método de obtención de anticuerpos y usos de los mismos.

La presente invención se refiere a la proteína de membrana PSAPL y a una nueva isoforma de PSAP (PSAPS) generada por splicing alternativo, así como métodos para la obtención de anticuerpos contra estas proteínas. También forman parte de la invención los métodos de detección, así como de obtención de moduladores de la actividad de dichas proteínas y su uso como agentes terapéuticamente activos

Isoformas de PSAP, determinantes antigénicos, método de obtención de anticuerpos y uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la proteína de membrana PSAP y a una nueva isoforma de PSAP (PSAPS) generada por splicing alternativo, así como métodos para la obtención de anticuerpos. También forman parte de la invención los métodos para la obtención de moduladores de la actividad de dichas proteínas y su uso como agentes terapéuticamente activos.

Estado de la técnica

La enfermedad de Alzheimer es una patología neurodegenerativa que se caracteriza a nivel celular por la acumulación extracelular de agregados de proteína constituidos principalmente por el péptido amiloide beta y ovillos intracelulares formados por proteína tau hiperfosforilada. Todavía no está claro qué evento es el responsable del comienzo de la enfermedad, pero se han encontrado varios factores posibles aparte de la formación de acúmulos de proteínas.

Algunos trabajos han relacionado la mitocondria con la enfermedad de Alzheimer, observándose que algunas de las proteínas implicadas en la enfermedad de Alzheimer, como las presenilinas, que son proteínas que participan en la producción del péptido amiloide beta a partir de su proteína precursora, betaAPP, interaccionan con proteínas implicadas en el proceso de muerte celular apoptótica que ejercen su función en la mitocondria.

Se ha observado que PSAP (presenilin 1- associated protein) o mtch1 (mitochondrial carrier homolog 1) una proteína mitocondrial que interacciona con la presenilina 1, induce el proceso de muerte celular apoptótica cuando sus niveles intracelulares son aumentados por sobreexpresión de la misma en células en cultivo. Esto sugiere que PSAP está relacionada con la muerte celular apoptótica en la enfermedad de Alzheimer y podría jugar un papel importante en diversas enfermedades degenerativas, así como en diversos tipos de cánceres.

PSAP no es la única proteína que interacciona con la Presenilina 1 y que está relacionada con las patologías anteriormente mencionadas. Una de estas proteínas distintas de PSAP, es la HPAP (Human Presenilin-asociated Protein), descrita en la solicitud de patente Norteamericana n° 09/116,640. En este documento se desarrolla un método para la obtención de anticuerpos contra dicha proteína para su uso tanto en el diagnóstico in vivo como in vitro.

En relación a PSAP, la primera referencia conocida a esta proteína y en la que se describe su relación con la Presenilina 1 fue realizada en 1999 (Xuemin Xu, Yong-chang Shi et al.,J Biol Chem, Vol. 274, Issue 46, 32543-32546, November 12, 1999, Identification of a Novel PSD-95/Dlg/ZO-1 (PDZ)-like Protein Interacting with the C Terminus of Presenilin-1). En este artículo se describen experimentos en los que la detección de la proteína PSAP se realiza mediante la adición en su extremo Carboxilo terminal de un marcador ("Myc tag") sobre el cual actúan anticuerpos denominados como "anti-myc".

En 2002, Xuemin Xu et al. (J Biol Chem. 2002 Dec 13;277(50):48913-22. Epub 2002 Oct 10. The novel presenilin-1-associated protein is a proapoptotic mitochondrial protein) describen la relación de PSAP con la apoptosis. En los experimentos la visualización de PSAP se realiza a través de la creación de una proteína quimérica de fusión entre PSAP y GFP (Green Fluorescence Protein). La detección de PSAP también se realiza con anticuerpos, tal y como fueron descritos en el articulo mencionado anteriormente de Xuemin Xu et al. 1999.

Hasta el momento son pocos los anticuerpos desarrollados que reaccionen directamente contra PSAP debido a la dificultad que entraña localizar epítopos o fragmentos antigénicos de esta proteína que funcionen correctamente por diferentes motivos:

Estos inconvenientes son solucionados con el método y elementos proporcionados para la obtención de anticuerpos contra PSAP en la presente invención.

Otro de los problemas solucionados por la presente invención radica en la necesidad de encontrar nuevas dianas hasta ahora desconocidas, que mejoren y permitan el estudio, prevención, diagnóstico y tratamiento de enfermedades entre las que se incluyen, pero no se limitan a, el Alzheimer o diferentes tipos de cáncer.

En este sentido, la invención proporciona una nueva isoforma de PSAP (PSAPS) generada por splicing alternativo, métodos para la obtención de agentes que modulen su actividad, además de un método para la generación de anticuerpos contra ésta, junto con los elementos para llevarlo a cabo. Dicha isoforma difiere de la isoforma actualmente incluida en el estado de la técnica, PSAPL, en la longitud de un brazo hidrofílico situado entre los dos dominios transmenbrana de la proteína.

Breve descripción de la invención

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado seleccionado de cualquiera de los siguientes grupos: i) polinucleótido que codifica para la secuencia SEQ ID 2; ii) polinucleótido cuya secuencia comprende la SEQ ID 1 o fragmentos de la misma; iii) polinucleótido cuya secuencia consiste en la SEQ ID 1; iv) polinucleótido que comprenda una secuencia que difiera de la secuencia del polinucleótido (iii) o fragmentos de (ii) debido a la degeneración del código genético; v) polinucleótido que codifique para un polipéptido que al menos muestre un 90% de homología con cualquiera de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos (i), (ii), (iii) o (iv); vi) polinucleótido que comprenda la SEQ ID 3 o un fragmento de la misma. En adelante nos referiremos a los polinucleótidos anteriormente mencionados como polinucleótidos de la invención.

En un aspecto de la presente invención el término fragmento se refiere a todas aquellos secuencias nucleotídicas comprendidas en los polinucleotidos de la invención que codifiquen polipéptidos capaces de ser utilizados como determinantes antigénicos para la generación de anticuerpos o como posibles dianas para la generación u obtención de moduladores de la actividad de PSAPS o PSAPL.

Un segundo aspecto de la invención se relaciona con un polipéptido aislado seleccionado de cualquiera de los siguientes grupos: i) polipéptido que consiste en la SEQ ID 2; ii) polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID 2; iii) polipéptido codificado por cualquiera de las secuencias de los polinucleotidos de la invención; iv) polipéptido que al menos muestre un 90% de homología con cualquiera de los péptidos (i), (ii), (iii) o (v); v) polipéptido que comprende la SEQ ID 4 o un fragmento de la misma. En adelante nos referiremos a los polipéptidos anteriormente mencionados como polipéptidos de la invención.

En otro aspecto de la presente invención el término fragmento se refiere a todas aquellos secuencias polipeptídicas comprendidas en cualquiera de los polipéptidos de la invención capaces de ser utilizadas como determinantes antigénicos para la generación de anticuerpos o como posibles dianas para la generación u obtención de moduladores de la actividad de PSAPS o PSAPL.

Un tercer aspecto de la invención los constituye una proteína de fusión que comprende al menos un polipéptido de la invención. Preferentemente dicho polipéptido comprende la SEQ ID 6. En adelante...

1. Polinucleótido aislado capaz de codificar para un polipéptido con capacidad inmunogénica frente a la PSAP, incluyendo cualquiera de sus isoformas, donde dicho polinucleótido es seleccionado del grupo que comprende:

2. Polipéptido con capacidad inmunogénica frente a la proteína PSAP, incluyendo cualquiera de sus isoformas, donde dicho polipéptido es seleccionado del grupo que comprende:

3. Proteína de fusión que comprende al menos un polipéptido según la reivindicación 2.

4. Proteína de fusión según reivindicación 3, cuya secuencia comprenda la SEQ ID 6.

5. Vector que comprenda cualquiera de los polinucleótidos de la reivindicación 1.

6. Vector según reivindicación 5 que comprenda a un polinucleótido de secuencia SEQ ID 3.

7. Célula huésped transformada con un vector según cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6.

8. Anticuerpos frente a PSAP capaces de interaccionar con cualquiera de los polipéptidos según la reivindicación 2.

9. Uso de cualquiera de los polipéptidos de la reivindicación 2 para la generación de anticuerpos capaces de interaccionar con la proteína PSAP.

10. Uso de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 3-4 para la generación de anticuerpos capaces de interaccionar con la proteína PSAP.