PLANTAS CON MAYOR ACTIVIDAD PLASTIDICA DEL ENZIMA R3 FOSFORILANTE DE ALMIDON.

Una célula de planta modificada genéticamente en la que los plástidos presentes en dicha célula de planta comprenden una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón,

consistiendo la modificación genética en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la célula de planta, seleccionándose la molécula de ácido nucleico extraña del grupo constituido por

a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3,

b) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en plásmido DSM 16587 o por la inserción en plásmido DSM 16645;

c) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Nº ID SEC 3;

d) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia tiene al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos que es codificada por la inserción en plásmido DSM 16587 o por la inserción en plásmido DSM 16645;

e) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en las Nº ID SEC 1 o Nº ID SEQ 2 o una secuencia complementaria;

f) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de la inserción presente en el plásmido DSM 16587 o en el plásmido DSM 16645;

g) moléculas de ácido nucleico que tienen al menos el 60% de identidad con las secuencias de ácido nucleico descritas en a), b) e) o f);

h) moléculas de ácido nucleico que se hibridan, en condiciones rigurosas con al menos una hebra de las moléculas de ácido nucleico descritas en a), b), e) o f);

i) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos, como consecuencia de la degeneración del código genético, deriva de la secuencia de moléculas de ácido nucleico citadas en a), b), e) o f); y

j) moléculas de ácido nucleico que constituyen fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de moléculas de ácido nucleico citadas en a), b), c), d), e), f), g), h) o i)

y en la que la molécula de ácido nucleico extraña es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en los ácidos nucleicos recombinantes donde la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón está condensada con las secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido de señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón y que además de su secuencia de aminoácidos de codificación tiene una secuencia de señal plastídica

Plantas con mayor actividad plastídica del enzima R3 fosforilante de almidón.

La presente invención se refiere a células de plantas y plantas que están modificadas genéticamente, conduciendo la modificación genética al aumento de la actividad de una proteína R3 fosforilante del almidón en comparación con células de planta de tipo salvaje o plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente. Además la presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para la generación de tales células de planta y plantas. Tales células de plantas y plantas sintetizan un almidón modificado. También se describe el almidón sintetizado por las células de plantas y plantas de acuerdo con la invención, procedimientos para la producción de este almidón y la producción de derivados de almidón de este almidón modificado, y harinas que comprenden este almidón.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas R3 fosforilantes de almidón y a vectores, células huésped, células de planta y plantas que comprenden tales moléculas de ácido nucleico. Además la presente invención se refiere a proteínas R3 que presentan una actividad fosforilante del almidón.

A la vista de la creciente importancia que se relaciona en la actualidad con constituyentes de plantas como materiales de partida renovables, una de las tareas de la investigación biotecnológica es intentar una adaptación de aquellos materiales de partida vegetales a los requerimientos de la industria del procesamiento. Con el fin de hacer posible el uso de materiales de partida renovables en tantos campos de aplicación como sea posible, es adicionalmente necesario llegar a sustancias muy diversas.

El polisacárido almidón está constituido por unidades químicamente uniformes, las moléculas de glucosa, pero constituye una mezcla compleja de diferentes formas de moléculas que difieren en lo que respecta a su grado de polimerización y ramificación y por tanto difieren enormemente en lo relativo a sus propiedades físico-químicas. Se distingue entre almidón de amilosa, un polímero esencialmente no ramificado de unidades de glucosa unidas 1,4-glicosídicamente, y almidón de amilopectina, un polímero ramificado donde los puntos ramificados se generan con la existencia de uniones alfa-1,6-glicosídicas adicionales. Una diferencia esencial más entre amilosa y amilopectina es el peso molecular. Mientras que la amilosa, en función del origen del almidón, presenta un peso molecular de 5 x 10⁵ - 10⁶ Da, el peso molecular de amilopectina se encuentra entre 10⁷ y 10⁸ Da. Las dos macromoléculas se pueden distinguir en base a su peso molecular y sus propiedades físico-químicas diferentes, y el modo más simple de visualizar esto se basa en sus diferentes propiedades de unión a yodo.

A la amilosa se ha referido desde hace tiempo como un polímero lineal constituido por monómeros de alfa-D-glucosa unidos alfa 1,4-glicosídicamente. Estudios más recientes, sin embargo, han revelado la presencia de puntos unidos alfa-1,6-glicísicos (aprox. 0,1%) (Hinzukuri y Takagi, Carbohydr. Res. 134, (1984), 1-10; Takeda y col., Carbohydr. Res. 132, (1984), 83-92).

Las propiedades funcionales de almidones, tales como, por ejemplo, solubilidad, comportamiento de retrogradación, la capacidad de unión a agua, las propiedades de formación de película, viscosidad, las propiedades de gelatinización, estabilidad frente a congelación-descongelación, la resistencia en gel, el tamaño de gránulo de almidón se ven, entre otros, influenciadas por la relación de amilosa/amilopectina, el peso molecular, el modelo de distribución de cadenas laterales, el contenido iónico, el contenido en lípidos y proteínas, el tamaño de gránulo de almidón medio, la morfología del gránulo de almidón y similares. Las propiedades funcionales de almidón se ven influenciadas también de forma particular por el contenido en fosfato, un componente no carbohidrato del almidón. Aquí se distingue entre fosfato que está unido covalentemente a moléculas de glucosa del almidón en la forma de monoésteres (en lo sucesivo designados como fosfato de almidón) y fosfato en la forma de fosfolípidos asociados con almidón.

El contenido en fosfato de almidón varía como una función de la variedad de planta. Así pues, por ejemplo, ciertos mutantes de maíz sintetizan un almidón con un mayor contenido de fosfato de almidón (maíz ceroso 0,002% y maíz de alto contenido en amilosa (0,013%), mientras que las variedades de maíz tradicional sólo contienen trazas de fosfato de almidón. Igualmente se han detectado pequeñas cantidades de fosfato de almidón en trigo (0,001%), mientras que no se ha detectado fosfato de almidón en avena y sorgo. Igualmente se ha encontrado menos fosfato de almidón en mutantes de arroz (arroz ceroso 0,003%) que en variedades de arroz tradicionales (0,013%). Se han detectado cantidades significativas de fosfato de almidón en plantas que sintetizan almidón almacenado en tubérculos o raíces, tales como, por ejemplo, tapioca (0,008%), boniato (0,011%), arruruz (0,021%) o patata (0,089%). Los porcentajes citados anteriormente para el contenido en fosfato de almidón se basan en todos los casos en el peso seco del almidón y se han determinado por parte de Jane y col. (1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832).

El fosfato de almidón puede estar presente en la forma de monoésteres en la posición C-2, C-3 o C-6 de los monómeros de glucosa polimerizados (Takeda y Hizukuri, 1971, Starch/Stärke 23, 267-272). Por lo general se distingue la distribución de fosfato del fosfato en almidón sintetizado en la planta por el hecho de que aproximadamente el 30% a 40% de los residuos de fosfato están unidos covalentemente a la posición C-3 y aproximadamente de 60% a 70% de los residuos de fosfato están unidos covalentemente a la posición C-6 de las moléculas de glucosa (Blennow y col., 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211-218). Blennow y col. (2000, Carbohidrate Polymers 41, 163-174) determinan un contenido en fosfato de almidón que está unido a la posición C-6 de las moléculas de glucosa para diferentes almidones tales como, por ejemplo, almidón de patata (entre 7,8 y 33,5 mmol por mg de almidón, en función de la variedad), almidón de diferentes especies de Curcuma (entre 1,8 y 63 nmol por mg), almidón de tapioca (2,5 nmol por mg de almidón), almidón de arroz (1,0 nmol por mg de almidón), almidón de frijol de mungo (3,5 nmol por mg de almidón) y almidón de sorgo (0,9 nmol por mg de almidón). No se detectó fosfato de almidón unido a la posición C-6 por parte de estos autores en almidón de cebada y en almidón de diferentes mutantes cerosos de maíz. Hasta la fecha no se ha establecido relación entre el genotipo de una planta y el contenido en fosfato del almidón (Jane y col., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). En la actualidad no es posible influir en el contenido de fosfato del almidón en plantas por procedimientos reproductivos de planta.

Hasta la fecha sólo se ha descrito una proteína que media la introducción de enlaces covalentes de residuos de fosfato en las moléculas de glucosa de almidón. Esta proteína tiene la actividad enzimática de un alfa-glucano, diquinasa de agua (GWD, E.C.: 2.7.9.4) (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171), se designa frecuentemente como R1 en la bibliografía científica y está unida a los gránulos de glucosa del almidón de almacenamiento en tubérculos de patata (Lorberth y col., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477). Debido a que el almidón de almacenamiento se sintetiza en plástidos (amiloplastos) y la proteína R1 está unida a estos gránulos de almidón, pero se codifica con ácido nucleicos localizados en el núcleo, la secuencia de aminoácidos se proporciona con un péptido señal plastídico (transitorio) (Lorberth y col., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477). En la reacción catalizada por R1 los materiales de partida alfa-1,4-glucano (almidón), adenosintrifosfato (ATP) y agua se transforman en los productos glucanfosfato (fosfato de almidón), monofosfato y adenosinmonofosfato. En este proceso el residuo de gamma-fosfato del ATP se transfiere a agua y el residuo beta-fosfato del ATP al glucano (almidón). El residuo de beta-fosfato se transfiere in vitro por R1 de ATP a las posiciones C-6 y C-3 de las moléculas de glucosa de alfa-1,4-glucanos. La relación de fosfato en C-6 con fosfato en C-3 que se obtiene en la reacción in vitro corresponde a la relación encontrada en almidón aislado de plantas (Ritte y col., 2002, PNAS 99, 7166-7171). Debido a que en el almidón de patata se encuentra...

1. Una célula de planta modificada genéticamente en la que los plástidos presentes en dicha célula de planta comprenden una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón, consistiendo la modificación genética en la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña en el genoma de la célula de planta, seleccionándose la molécula de ácido nucleico extraña del grupo constituido por

y en la que la molécula de ácido nucleico extraña es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en los ácidos nucleicos recombinantes donde la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón está condensada con las secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido de señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón y que además de su secuencia de aminoácidos de codificación tiene una secuencia de señal plastídica.

2. La célula de planta como se reivindica en la reivindicación 1 que sintetiza un almidón modificado en comparación con células de plantas de tipo salvaje no modificadas genéticamente correspondientes, en las que el almidón modificado comprende un mayor contenido de fosfato en almidón y/o una distribución de fosfato modificada.

3. Una planta que comprende células de planta modificadas genéticamente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

4. La planta que se reivindica en la reivindicación 3, que es una planta que almacena almidón.

5. Material de reproducción de una planta como se reivindica en la reivindicación 3 ó 4, que comprende una célula de planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

6. Una parte de planta cultivable de una planta que se reivindica en las reivindicaciones 3 ó 4, que comprende una célula de planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Un procedimiento de generación de una planta modificada genéticamente, en la que

en el genoma de la célula de planta, en el que dicha molécula de ácido nucleico extraña es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en los ácidos nucleicos recombinantes en los que una secuencia de ácido nucleico codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón está condensada con una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido se señal plastídico de modo que la molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón y que además de su secuencia de aminoácidos de codificación presenta un péptido señal plastídico,

8. Un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la etapa de extraer el almidón de una célula de planta como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o extraer el almidón de una planta como se reivindica en la reivindicación 3 ó 4.

9. Un procedimiento para la producción de un almidón modificado, que comprende la etapa de extraer el almidón de partes de plantas cultivables como se reivindica en la reivindicación 6.

10. Un procedimiento para la producción de harinas que comprende la etapa de moler partes de plantas como se reivindican en la reivindicación 3 ó 4 o de material de reproducción como se reivindica en la reivindicación 5 o material cultivable como se reivindica en la reivindicación 6.

11. El uso de un célula de planta modificada genéticamente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o de una planta como se reivindica en la reivindicación 3 ó 4 para la producción de una harina.

12. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con la actividad enzimática de una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón, seleccionada del grupo constituido por

y en la que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias adicionales que no se encuentran presentes de forma natural en una combinación en la que están presentes en el ácido nucleico recombinante, donde la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón se condensa con secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido de señal plastídico.

13. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 12.

14. El vector que se reivindica en la reivindicación 13, en el que la molécula de ácido nucleico se une con secuencias regulatorias que inician la transcripción en células procarióticas o eucarióticas.

15. Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 12, o un vector como se reivindica en la reivindicación 13 ó 14.

16. Una composición que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 12, o un vector como se reivindica en la reivindicación 13 ó 14.

17. El uso de una composición como se reivindica en la reivindicación 16 para identificación de células de plantas que, en comparación con células de planta de tipo salvaje no modificadas genéticamente muestran una mayor actividad de una proteína que transfiere un residuo de fosfato desde un nucleósido trifosfato a almidón.

18. Una proteína con actividad fosforilante del almidón seleccionada del grupo constituido por

19. Una proteína recombinante que comprende secuencias de aminoácido que codifican una proteína de acuerdo con la reivindicación 18 condensada con secuencias de aminoácido que codifican un péptido señal plastídico.

20. La proteína que se reivindica en la reivindicación 18 ó 19, que tiene un dominio de fosfohistidina.