OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO QUE INHIBEN LA EXPRESION DE HIF-1.

Oligonucleótido que es la SEC ID nº 2, dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica HIF-1 humano,

en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del HIF-1 humano

Oligonucleótidos antisentido que inhiben la expresión de HIF-1.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un compuesto oligonucleótido antisentido, RX-0047, que inhibe la expresión de una proteína humana, el HIF-1, e induce asimismo citotoxicidad en diversas líneas celulares cancerosas.

Antecedentes de la invención

Los tumores no pueden crecer sin vasos sanguíneos que suministren a las células cancerosas oxígeno y nutrientes (Blagosklonny, International J. Oncol., 2001, 19: 257-262). El control de la respuesta hipóxica en células de mamíferos mediante el factor de transcripción HIF-1 es uno de los mayores reguladores del crecimiento de células cancerosas. HIF hace que las células puedan sobrevivir a la hipoxia y estimular el crecimiento endotelial, y se regula al alza en un amplio espectro de cánceres (Zhong y otros, Cancer Res. 1999 59: 5830-5835). Uno de los ejemplos más sorprendentes del papel del HIF en la angiogénesis y la progresión tumoral es la pérdida de función de la proteína VHL, que es un gen supresor tumoral que está mutado en la mayoría de carcinomas renales de célula clara esporádicos y en la enfermedad de VHL. En consecuencia, la disrupción de la ruta del HIF-1 inhibe el crecimiento tumoral, señalando el HIF-1 como diana anticancerígena potencial. La inhibición del HIF-1 es una estrategia antiangiogénica basada en mecanismo porque es la respuesta mediada por HIF-1 la que conduce la angiogénesis tumoral. La patente US nº 6.222.018, concedida a Semenza, 24 de abril de 2001, se refiere a las secuencias de nucleótidos que codifican el HIF-1. Los oligonucleótidos específicos dados a conocer y reivindicados en la presente invención no fueron dados a conocer en dicha patente. La publicación de patente WO 00/76497 da a conocer un compuesto de HIF-1 antisentido de longitud completa que inhibe el crecimiento tumoral.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: RX-0047 y RX-0149 inhiben la expresión de ARNm de HIF-1 en diversas células cancerosas;

Figura 2: análisis por Western blot de la inhibición de la expresión de proteína HIF-1 mediante RX-0047 y RX-0149.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un oligonucleótido antisentido que se dirige a un ácido nucleico que codifica HIF-1 (factor inducible por hipoxia tipo 1), y que modula la expresión de HIF-1. También se da a conocer un procedimiento para inhibir la expresión de HIF-1 en células que comprende poner en contacto dichas células con el oligonucleótido según la presente invención. Una ventaja del oligonucleótido descrito en la presente invención consiste en que, además de inhibir la expresión de HIF-1, presenta un efecto citotóxico sobre diferentes líneas celulares cancerosas. Las ventajas de la presente invención se pueden obtener poniendo en contacto células de diversas líneas celulares cancerosas con un compuesto antisentido que es específicamente hibridizable a un sitio sobre el gen de HIF-1 que presenta la secuencia siguiente: 5' ttggacactggtggctcatt 3' en el sitio 2.772 del gen de HIF-1 (Genebank # NM001530) (SEC ID nº 1). El compuesto antisentido es RX-0047, 5' aatgagccaccagtgtccaa 3' (SEC ID nº 2). El contacto tiene lugar en condiciones que permiten que el oligonucleótido se hibridice con el gen que codifica el HIF-1. Tras la hibridización, se inhibe la capacidad de las células de producir HIF-1 y se reduce la viabilidad de las células cancerosas.

Descripción detallada de la invención

El HIF (factor inducible por hipoxia) es un factor de transcripción heterodimérico clave y se activa por hipoxia. No únicamente media en respuestas homeostáticas que incluyen eritropoyesis, angiogénesis y glicólisis a la hipoxia en mamíferos, sino que también facilita la neovascularización y el crecimiento tumorales. Se compone de 2 subunidades diferentes, HIF-1a y HIF-1ß, también conocido como ARNT (translocador nuclear del receptor arilo). Estas 2 subunidades pertenecen a la familia bHLH (hélice-bucle-hélice básico) y PAS (Per, ARNT, Sim). El dominio bHLH de estos factores es responsable de la dimerización a través de dos hélices y de que el ADN se enlace a través de su dominio básico. Dos dominios separados dentro de HIF-1a y HIF-2a responden a rutas de señalización de hipoxia. El primero es la degradación dependiente de oxígeno (ODD), que, en normoxia, está sujeta a modificación de traducción por parte de una prolil hidroxilasa dependiente de oxígeno (Jaakkola y otros, Science, 2001, 292: 468-472). La prolina hidroxilada promociona la interacción del HIF con el complejo de ubiquitina ligasa VHL (von Hippel-Lindau), iniciando una rápida ubiquitinación y una subsiguiente destrucción de la proteína HIF a través de proteasomas. Un informe reciente indicó que la hidroxilación de asparagina del dominio de transactivación del terminal COOH (CAD) también tiene un papel importante en la degradación del HIF mediada por proteasa inhibiendo la interacción con el coactivador p300/CBP, y reduce la actividad transcripcional del HIF-1 durante la normoxia (Lando y otros, Science, 2002, 295: 858-861). En consecuencia, en conjunción con la prolil hidroxilasa, la asparagina hidroxilasa actúa como un interruptor hipóxico regulado por el nivel de O₂ en la célula. Durante la hipoxia, la actividad de p42/p44 MAPK induce la fosforilación post traducción del HIF-1 y favorece la actividad transcripcional del HIF-1. Un informe reciente mostró que, junto con la hidroxilación, ubiquitinación y fosforilación, la acetilación tiene un papel importante en la regulación de la estabilidad del HIF-1 (Jeong y otros, Cell, 2002, 111: 709-720).

Bajo hipoxia, el HIF-1a no se hidroxila porque la hidroxilasa, que requiere dioxígeno para su actividad, es inactiva y, de este modo, el HIF-1a no es reconocido por pVHL y se acumula en la célula. A continuación, el HIF-1a transloca al núcleo y se dimeriza con la subunidad de HIF-1ß constitutivamente presente (Semenza, Genes & Development, 1985, 14: 1983-1991). A continuación, el dímero se enlaza al elemento de respuesta a la hipoxia (HRE) en los genes diana, lo que resulta en la transactivación de genes como eritropoyetina, VEGA (Forsythe y otros, Mol. Cell. Biol., 1996, 16: 4604-4613), factor ß de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-ß), transportador de glucosa (GLUT1) y óxido nitroso sintetasa (Neckers, J. Natl. Cancer Ins., 1999, 91: 106-107). Algunas hormonas y factores de crecimiento también conducen a niveles más elevados de HIF-1a, así como mutaciones en determinados oncogenes y genes supresores tumorales, por ejemplo VHL, que resulta en un aumento del nivel de HIF-1a (Ivan y Kaelin, Current Opinion in Genetics & Development, 2001 11: 27-34). Resultará interesante determinar si la hidroxilación o mecanismos alternativos están implicados en esta activación del HIF independiente de la hipoxia.

Diversas estrategias actuales para las terapias anticáncer que aprovechan el microentorno y la respuesta hipóxicos son: 1) fármacos o vectores de terapia génica dependientes de hipoxia, 2) inhibición de la estabilidad de HIF, 3) inhibición de la transactivación por HIF, y 4) inhibidores de VEGA.

Dado el papel clave del factor de transcripción HIF en el desarrollo de cánceres, sería deseable inhibir su actividad durante la oncogénesis. Sin embargo, también sería deseable, hasta donde sea posible, evitar la interrupción de los papeles de la familia en otros aspectos del metabolismo celular. Un enfoque puede consistir en identificar el gen que codifica un factor de transcripción probable que es altamente expresado durante la hipoxia, y diseñar un oligonucleótido antisentido que puede ser utilizado para inhibir la actividad de dicho gen en el contexto adecuado. En el contexto de la presente invención se han descubierto que dos oligonucleótidos antisentido exhiben una capacidad aumentada de inhibir la producción de proteína mediante el gen de HIF-1, y además inducen citotoxicidad en una variedad de líneas celulares cancerosas.

Un compuesto antisentido es una herramienta que puede ser utilizada con el fin de introducir modificaciones en los ácidos nucleicos que se encuentran en las células vivas. El término "antisentido" se refiere al concepto de que los ácidos nucleicos "codifican" proteínas. Es decir, la secuencia de nucleótidos en contra de un determinado ácido nucleico determina, entre otras cosas, qué proteína se producirá. Una secuencia "sentido" para un gen completo dará lugar a una proteína normal en la cantidad habitual, como respuesta a un determinado estímulo. Un oligonucleótido "sentido" se hibridizará con una secuencia...

1. Oligonucleótido que es la SEC ID nº 2, dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica HIF-1 humano, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del HIF-1 humano.

2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido.

3. Oligonucleótido antisentido según la reivindicación 2, que presenta por lo menos un enlace internucleósido modificado que es un enlace fosforotioato.

4. Procedimiento de tratamiento de células o tejidos humanos in vitro, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el oligonucleótido según la reivindicación 1.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que se inhibe la expresión de HIF-1.

6. Procedimiento de tratamiento de una célula cancerosa in vitro que comprende la etapa que consiste en introducir en la célula un oligonucleótido que es la SEC ID nº 2, que hibrida el HIF-1 humano.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que se induce la citotoxicidad.

8. Oligonucleótido según la reivindicación 1, para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico de un humano o un animal mediante terapia.

9. Utilización de un compuesto según la reivindicación 1 en la preparación de una composición para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico de un animal o un humano mediante terapia.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la que el procedimiento de tratamiento es el tratamiento del cáncer.

11. Oligonucleótido según la reivindicación 1, para su utilización en el tratamiento del cáncer.