LINEAS CELULARES DE HEPATOMAS HUMANOS, SU OBTENCION Y SUS APLICACIONES.

Línea celular de hepatomas como la depositada el 5 de abril de 2001 en el CNCM, con el nº I-2652

Líneas celulares de hepatomas humanos, su obtención y sus aplicaciones.

La invención se refiere a nuevas líneas celulares de hepatomas humanos. Se refiere también a su obtención por selección celular con ayuda de corticosteroides y DMSO, y a sus aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas y profilácticas.

La hepatitis B es una enfermedad infecciosa muy extendida por el mundo. Su virus (VHB de forma abreviada) es un virus pequeño de ADN que tiene una alta especificidad por el huésped. En efecto, solamente el hombre y los primates superiores son infectados por este virus, lo cual limita mucho los modelos de estudios in vivo de esta infección. Sin embargo, existe un modelo llamado "del pato" que permite estudiar un ciclo entero de replicación de un hepadnavirus (in vitro o in vivo). Sin embargo, este hepadnavirus, aunque cercano al virus VHB, presenta una biología bastante diferente. Por otra parte, los comportamientos metabólicos del pato no pueden compararse simplemente con los del hombre.

El VHB presenta además un fuerte tropismo hepático y se dirige con preferencia a las células parenquimatosas. Además, a diferencia de otros virus, solo las células hepáticas diferenciadas son susceptibles de ser infecta- das.

Una línea celular derivada de hepatomas ha permitido rápidos avances en la comprensión de los mecanismos de replicación. Esta línea celular ampliamente usada se denomina HepG2. Un clon derivado de HepG2 2.2.15, presenta la ventaja de tener una gran capacidad de proliferación y de replicar el virus activamente. Sin embargo, esta replicación solo es posible después de introducir el ADN vírico en las células por transfección. Se ha probado que es imposible la infección natural de esta línea celular por el VHB. Además, debido a la antigüedad de esta línea celular, el cariotipo de sus células se ha modificado mucho, lo cual hace que sea un modelo imperfecto para imitar los hepatocitos humanos. Por último, la capacidad de diferenciación de estas células es bastante limitada.

Se han propuesto otras líneas celulares más o menos diferenciadas. Se citará en particular la línea celular Hep3B, poco diferenciada de la línea celular HepG2, y que presenta los mismos límites que ésta. Estas dos líneas son en particular el objeto de la patente US 4393133, y de artículos de Neurath y col. J. exper. med., nº 175, 1992, páginas 461-469, y de Chiu y col., Hepathology, volumen 11, nº 5, 1990, páginas 834-842. Todos los ensayos de infección de líneas celulares han demostrado ser negativos o decepcionantes en términos de eficacia.

Para estudiar los mecanismos de infección por el VHB, se ha desarrollado un modelo de hepatocitos humanos en cultivo primario. Este modelo presenta el interés de que concierne a hepatocitos humanos y permite el acceso al conjunto del ciclo vírico. Sin embargo, su manipulación es difícil y fastidiosa, y además la obtención de fragmentos de biopsia es difícil y aleatoria.

Los trabajos de los autores de la invención en este campo, les han llevado a constatar que se pueden obtener líneas celulares de hepatomas humanos que se multiplican activamente aunque son infectables por parási- tos y/o virus, en especial por el VHB, pudiéndose obtener mediante una selección celular en condiciones específi- cas.

Por lo tanto, la invención se dirige a proporcionar nuevas líneas celulares de hepatomas humanos infectables por parásitos y/o virus, y las células o elementos de estas células resultantes de estas líneas celulares.

Se dirige igualmente a un procedimiento de selección de dichas líneas.

La invención tiene también por objeto aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas y profilácticas de estas líneas celulares.

De acuerdo con la presente invención, las líneas celulares de hepatomas humanos se caracterizan por ser susceptibles de ser infectadas de forma natural por parásitos y/o virus; pudiendo ser dichos parásitos hepatotropos o no, tales como Plasmodium o los parásitos del género leishmania; y expresan receptores de la familia de los virus Flaviviridae y Hepadnaviridae, preferiblemente el VHB y VHC.

Estas líneas celulares nuevas permiten así el estudio completo del ciclo de los parásitos y/o los virus, en particular el ciclo vírico del VHB, desde la etapa de infección natural hasta la replicación y/o la propagación del virus. En este aspecto, se observará que hasta el momento ninguna línea celular de hepatomas humanos es infectable por Plasmodium falciparum, es decir que ninguna línea celular de hepatomas humanos es susceptible de soportar el desarrollo de formas maduras de este parásito hepatotropo (esquizontes). Además, debido a su capacidad de proliferación, estas líneas celulares presentan gran facilidad de manipulación.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, estas líneas celulares pueden alcanzar un nivel de diferenciación elevado.

En particular, las células derivadas de las líneas celulares según la invención, permiten alcanzar un estado de diferenciación hepático, es decir, una morfología próxima a la de las células que constituyen el hígado, tales como los hepatocitos y/o las células biliares, en particular con:

En toda la solicitud se hará referencia a nociones típicas de la organización estructural de las células hepáticas. Estas nociones, en particular el polo biliar, se explican en el preámbulo del apartado "Resultados" del ejemplo 1, más adelante. Es sorprendente constatar que las células derivadas de las líneas celulares según la invención son capaces de imitar casi de forma idéntica la organización estructural de estas células hepáticas y de reproducir sus funciones: en efecto, los canalículos biliares formados por las células de las líneas celulares según la invención, son funcionales, es decir son capaces de realizar su función de destoxificación. Esta diferenciación funcional es además muy elevada: las células de las líneas celulares de hepatomas humanos según la invención pueden expresar las funciones características del hepatocito, a saber:

Es interesante observar que ninguna línea celular de hepatomas humanos era capaz de producir células que pudieran alcanzar un nivel de diferenciación tal que sus células pudieran expresar la casi totalidad de las funciones del hepatocito humano normal, en particular, las funciones de destoxificación de las fases I y II (CYP2E1, CYP3A, CYP1A y GSTa).

Según un aspecto inesperado, las células derivadas de las líneas celulares según la invención tienen propiedades de células pluripotentes, en particular, propiedades de células madre residentes y/u ovaladas, es decir capaces de diferenciarse hacia la ruta hepatocitaria, biliar, pancreática y/o intestinal.

El artículo de Zvibel y col., Differentiation, volumen 63, nº 4, 1998, páginas 215-223, describe líneas celulares de hepatomas de rata que presentan marcadores biliares que evolucionan hacia un estado precoz de diferenciación hepatocitaria. Estas líneas celulares no tienen pues la capacidad de diferenciarse por la ruta hepatocitaria, biliar, pancreática e intestinal. Las células madre residentes son células del hígado capaces, después de una destrucción masiva de éste, de multiplicarse activamente con el fin de regenerar la parte destruida. Estas células pueden evolucionar hacia un linaje hepatocitario o biliar (Figura...

1. Línea celular de hepatomas como la depositada el 5 de abril de 2001 en el CNCM, con el nº I-2652.

2. Procedimiento de infección de células hepáticas por un parásito hepatotropo y/o un virus, con una fase de selección que comprende una fase de proliferación celular en un medio de cultivo que comprende de forma continua al menos un corticosteroide en una concentración no tóxica que favorece la diferenciación de hepatocitos humanos normales, después, tras alcanzar la confluencia, una fase de diferenciación celular en el mismo medio por adición de DMSO en cantidad suficiente para inducir la diferenciación,

repitiéndose este procedimiento varias veces, preferiblemente 3 veces, si se desea,

estando dicho procedimiento caracterizado porque comprende

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque los medios usados comprenden insulina, en una relación de 2,5 µg/ml a 10 µg/ml para favorecer la supervivencia de los hepatocitos humanos normales.

4. Procedimiento de transfección de la línea celular según la reivindicación 1, con ayuda de un vector que comprende la secuencia completa y/o una parte del material genético de los virus del VHB y/o VHC.

5. Procedimiento de selección de alto caudal de genes expresados de forma diferencial con ayuda de una herramienta de tipo chip producida a partir la línea celular según la reivindicación 1, expresándose estos genes de forma diferencial bajo el efecto de las condiciones de cultivo, exposición a una molécula y/o un virus y/o un parásito.

6. Uso de la línea celular según la reivindicación 1, para ensayos metabólicos y/o de toxicidad dirigidos a la evaluación de nuevos medicamentos y/o de constituyentes nutricionales y/o de contaminantes del entorno.

7. Uso de la línea celular según la reivindicación 1, para la fabricación de un biorreactor extracorpóreo para tratar transitoriamente las insuficiencias hepatocelulares agudas.

8. Uso de la línea celular según la reivindicación 1, para selección y/o fabricación de nuevas vacunas y/o de moléculas antivíricas, en particular para la selección de moléculas activas frente a una de las etapas del ciclo vírico.