USO DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CONTIENEN DINUCLEOTIDO CPG NO METILADO EN COMBINACION CON ALUMBRE COMO ADYUVANTE.

Una composición farmacéutica, para activación de una respuesta inmunitaria en un mamífero,

que comprende un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado, en combinación con alumbre y una cantidad eficaz de un polipéptido o proteína antigénico

Uso de ácidos nucleicos que contienen dinucleótido CpG no metilado en combinación con alumbre como adyuvante.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a adyuvantes, y específicamente al uso de oligonucleótidos que tienen al menos un dinucleótido CpG no metilado (CpG ODN) como adyuvante, en combinación con alumbre.

Antecedentes de la invención

El DNA bacteriano, pero no el DNA de los vertebrados, tiene efectos inmunoestimulantes directos sobre las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) in vitro (Krieg et al., 1995). Esta activación de los linfocitos es debida a dinucleótidos CpG no metilados, que están presentes con la frecuencia esperada en el DNA bacteriano (1/16), pero están infra-representados (supresión de CpG, 1/50 a 1/60) y metilados en el DNA de los vertebrados. La activación puede ser desencadenada también por adición de oligodesoxinucleótidos (ODN) sintéticos que contienen un dinucleótido CpG no metilado, en un contexto de secuencia particular. Parece probable que la activación inmunitaria rápida en respuesta al DNA de CpG puede haberse desarrollado como un componente de los mecanismos de defensa inmunes innatos que reconocen patrones estructurales específicos de las moléculas microbianas.

El DNA de CpG induce proliferación de prácticamente la totalidad (>95% de las células B y aumenta la secreción de inmunoglobulinas (Ig). Esta activación de las células B por el DNA de CpG es independiente de las células T e inespecífica de antígenos. Sin embargo, la activación de las células B por concentraciones bajas de DNA de CpG exhibe una fuerte sinergia con señales suministradas a través del receptor de antígeno de las células B tanto para proliferación de las células B como para secreción de Ig (Krieg et al., 1995). Esta fuerte sinergia entre los caminos de señalización de las células B desencadenados por el receptor de antígeno de las células B y por DNA de CpG promueve respuestas inmunitarias específicas de antígeno. Además de sus efectos directos sobre las células B, el DNA de CpG activa también directamente monocitos, macrófagos, y células dendríticas para secretar una diversidad de citoquinas, que incluyen niveles altos de IL-12 (Klinman et al., 1996; Halpern et al., 1996; Cowdery, et al., 1996). Estas citoquinas estimulan las células agresoras naturales (NK) a secretar g-interferón (IFN-g) y tienen actividad lítica incrementada (Klinman et al., (1996), supra; Cowdery et al., 1996, supra; Yamamoto et al., 1992; Ballas et al., 1996). Globalmente, el DNA de CpG induce un patrón semejante a Th1 de producción de citoquinas dominado por IL-12 e IFN-g con poca secreción de citoquinas Th2 (Klinman et al., 1996). El intenso efecto directo (independiente de las células T) del DNA de CpG sobre las células B, así como la inducción de citoquinas que podrían tener efectos indirectos sobre las células B por caminos adyuvantes T, sugiere utilidad del DNA de CpG en la forma de ODN como adyuvante de vacunas.

Una vacuna de DNA induce respuestas inmunitarias contra una proteína antigénica expresada in vivo por un gen introducido. La vacuna de DNA se encuentra en la mayoría de los casos en la forma de un vector de expresión de DNA plasmídico producido en bacterias y purificado y suministrado luego a los músculos o la piel (véase Vogel y Sarver, 1995; Brazolot Millan y Davis, 1997; Donnelly et al., 1996). Se ha demostrado que las vacunas de DNA exhiben eficiencia contra numerosas enfermedades virales, bacterianas y parasitarias en animales modelo. Prácticamente todos los estudios demuestran la inducción de respuestas inmunitarias muy fuertes y de larga duración humorales y medidas por células, así como la protección contra la exposición a patógenos vivos (en los casos en que pudo evaluarse). La eficacia de las vacunas de DNA se atribuye, al menos en parte, a la continua síntesis in vivo de antígeno que conduce a una presentación de antígeno eficiente. En particular, el antígeno sintetizado endógenamente es presentado por el MHC de clase I, conduciendo a la inducción de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL). En contraste, la mayoría de las vacunas completas muertas y subunitarias, en las cuales el antígeno está procesado únicamente en la forma exógena, fracasan a menudo en lo tocante a la inducción de CTL. Más recientemente, sin embargo, se ha demostrado que la presencia de motivos CpG no metilados en las vacunas de DNA es esencial para la inducción de respuestas inmunitarias contra el antígeno (Sato et al., 1996).

El virus de la hepatitis B (HBV) plantea un problema sanitario grave de alcance mundial. Las vacunas de HBV actuales son vacunas subunitarias que contienen partículas de proteínas de la cubierta de HBV (que incluyen varios epítopes de células B y células T conocidos colectivamente como antígeno de superficie de HBV (HBsAg). Las partículas de HBsAg pueden purificarse a partir del plasma de los individuos infectados crónicamente o, más comúnmente, se producen como proteínas recombinantes. Estas vacunas inducen anticuerpos contra HBsAg (anti-HBs), que confieren protección si están presentes en títulos de 10 mini-unidades internacionales por mililitro (mUI/ml) (Ellis, 1993). Si bien las vacunas subunitarias son seguras y generalmente eficaces, no logran cumplir todas las necesidades de la vacunación actuales. Por ejemplo, la vacunación precoz de los niños recién nacidos de madres infectadas crónicamente, y de otras en áreas endémicas, reduce drásticamente la tasa de infección, pero una proporción importante de estos niños estarán infectados a su vez crónicamente. Esto podría reducirse posiblemente si pudieran inducirse títulos elevados de anticuerpos anti-HBs con anterioridad y si existieran CTL específicos de HBV. Adicionalmente, existen ciertos individuos que no logran responder (no sensibles) o no alcanzan niveles de inmunidad protectores (hiposensibles). Finalmente, existe una necesidad urgente de un tratamiento eficaz para los 350 millones estimados de portadores crónicos de HBV, y una vacuna terapéutica podría satisfacer esta necesidad.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de que los ácidos nucleicos que contienen al menos un dinucleótido citosina-guanina (CpG) metilado afectan a la respuesta inmunitaria en un individuo por activación de las células agresoras naturales (NK) o redireccionamiento de la respuesta inmunitaria de un individuo desde una respuesta de Th2 a una respuesta Th1 por inducción de las células monocíticas y otras a producir citoquinas Th1. Estos ácidos nucleicos que contienen al menos un CpG no metilado se utilizan en combinación con alumbre como adyuvante, para inducir una respuesta inmunitaria contra una proteína antigénica.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, para activar una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado, en combinación con alumbre y una cantidad eficaz de un polipéptido o proteína antigénico. Características preferidas y otros aspectos de la invención se describen también en las reivindicaciones adjuntas.

En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica para tratar un individuo que sufre o se encuentra en riesgo de sufrir un trastorno mediado vitalmente por administración al individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína antigénica viral y una cantidad eficaz de un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado y alumbre.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 es un gráfico que ilustra respuestas humorales en ratones BALB/c inmunizados con 1 g de proteína HBsAg recombinante sola, adsorbida en alumbre (25 mg de Al³⁺/mg HBsAg), con 100 µg de CpG ODN inmunoestimulante, o a la vez con alumbre y CpG ODN. Cada punto representa el valor medio de grupo (n = 10) para títulos anti-HBs (IgG total) como se determina por triplicado en el ensayo ELISA de dilución en el punto final. Los títulos en el punto final se definieron como la dilución máxima del plasma que daba como resultado un valor de absorbancia (DO 450) dos veces mayor que el del plasma de control no inmune con un valor de corte de 0,05. El gráfico superior muestra los resultados en escala lineal, y el gráfico inferior muestra los resultados en escala logarítmica (log₁₀).

Fig. 2 es un gráfico que ilustra respuestas humorales en...

1. Una composición farmacéutica, para activación de una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado, en combinación con alumbre y una cantidad eficaz de un polipéptido o proteína antigénico.

2. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el mamífero es un humano.

3. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el polipéptido antigénico comprende un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

4. Una composición farmacéutica, para activar una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado, en combinación con alumbre y una cantidad eficaz de un polipéptido antigénico, en donde el polipéptido comprende una antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

5. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el mamífero es un humano.

6. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha composición tiene por objeto inducir una respuesta inmunitaria contra una proteína antigénica, tratar un individuo que padece o se encuentra en riesgo de padecer una infección viral crónica, administrar a un individuo que padece o se encuentra en riesgo de padecer un trastorno mediado por un virus, inducir una respuesta Th1 y/o tratar un recién nacido para inducir una inmunidad específica para HBV.

8. Una composición que comprende un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado, alumbre y un polipéptido antigénico que es el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B para uso en el tratamiento de un individuo que padece o se encuentra en riesgo de padecer una infección viral crónica.

9. Una composición que comprende un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado, alumbre y un ácido nucleico que codifica el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B para uso en la inducción de una respuesta inmunitaria.