MUTANTES DE LACTOBACILUS CASEI CON REGULACION DEFECTUOSA DEL CATABOLISMO DEL CARBONO.

Utilización de un mutante de L. casei que presenta por lo menos una mutación en el gen ptsH,

en la que dicha mutación perjudica la regulación de un mecanismo de represión catabólica por carbono (CCR) que implica la proteína PTS HPr, para la preparación de un producto alimentario

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06022678.

Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
COMPAGNIE GERVAIS DANONE
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC)
.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 3, RUE MICHEL ANGE,75016 PARIS.

Inventor/es: PEREZ MARTINEZ,GASPAR, BENBADIS, LAURENT, DEUTSCHER,JOSEF, MONEDERO GARCIA,VICENTE, PIERSON,ANNE, FAURIE,JEAN-MICHEL, VIANA BALESTER,ROSA.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 30 de Marzo de 2001.

Fecha Concesión Europea: 1 de Julio de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/335 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Lactobacillus (G).
  • C12N9/12B1
  • C12R1/245 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Lactobacillus casei.

Clasificación PCT:

  • A23C19/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A23 ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO, NO CUBIERTO POR OTRAS CLASES.A23C PRODUCTOS LACTEOS, p. ej. LECHE, MANTEQUILLA, QUESO; SUCEDANEOS DE LA LECHE O DEL QUESO; SU FABRICACION (obtención de composiciones a base de proteínas para la alimentación A23J 1/00; preparación de péptidos, p. ej. de proteinas, en general C07K 1/00). › Queso; Preparados a base de queso; Fabricación de estos productos (sucedáneos del queso A23C 20/00; caseína A23J 1/20).
  • A23C9/12 A23C […] › A23C 9/00 Preparados a base de leche; Leche en polvo o preparados a base de leche en polvo (A23C 21/06 tiene prioridad; conservación A23C 3/00; leche chocolatada A23G 1/00; helados o mezclas para la preparación de helados A23G 9/00; pudins o postres o postres hechos con polvos secos A23L 9/10). › Preparados a base de leche fermentada; Tratamientos que utilizan microorganismos o enzimas (preparados a base de suero A23C 21/00).
  • C07K14/335 C07K 14/00 […] › de Lactobacillus (G).
  • C12N1/20 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12N15/31 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
  • C12N15/54 C12N 15/00 […] › Transferasas (2).
  • C12N9/12 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
  • C12R1/245 C12R 1/00 […] › Lactobacillus casei.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Finlandia, Chipre.


Fragmento de la descripción:

Mutantes de Lactobacilus casei con regulación defectuosa del catabolismo del carbono.

La presente invención se refiere a cepas mutantes de las bacterias del grupo Lactobacillus casei con una ruta de regulación del catabolismo del carbono defectuosa, y a su utilización en el procesamiento de alimentos fermentados.

Tal como se define en la presente memoria, el grupo Lactobacillus casei incluye las especies L. casei, así como las especies L. paracasei (antiguamente subespecie paracasei de L. casei), L. rhamnosus (antiguamente subespecie rhamnosus de L. casei) y L. zeae. Esas especies están filogenéticamente emparentadas, de manera muy cercana, entre sí y sus respectivos genes ADNr 16S y 23S siempre muestran una similitud superior al 97,5% [Mori et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 54-57, (1997)].

L. casei es reconocida como un prebiótico, es decir, un suplemento alimentario microbiano vivo con un efecto positivo sobre la salud del consumidor, y se utiliza mucho como iniciador en la industria láctica y en la preparación de alimentos fermentados, más específicamente, alimentos que contienen fermentos vivos.

La represión catabólica por carbono (CCR) es un mecanismo regulador que permite a las bacterias elegir entre diferentes fuentes de carbono según su valor metabólico y cambiar de una fuente de carbono a otra en función de su disponibilidad en el medio de cultivo. Una manifestación de la represión catabólica bien conocida es el crecimiento diáuxico que ocurre cuando las bacterias son cultivadas en presencia de glucosa y lactosa. Las curvas de crecimiento diáuxico muestran dos etapas distintas de crecimiento exponencial, separadas por un periodo de reposo. Durante la primera etapa de crecimiento, la glucosa reprime la síntesis de las enzimas necesarias para la utilización de lactosa, y por lo tanto, es la única fuente de energía de las bacterias. Cuando toda la glucosa es consumida, se da la etapa de reposo, durante la cual se sintetizan las enzimas para la utilización de la lactosa, permitiendo que la lactosa sea utilizada como una fuente de energía durante la segunda etapa del crecimiento.

Un objetivo principal de la represión catabólica es el transporte de azúcares al interior de las células bacterianas. En la L. casei, este transporte se realiza predominantemente mediante fosfoenolpiruvato: sistema fosfotransferasa de azúcares (PTS).

El PTS de las bacterias gram positivas ha sido estudiado principalmente en Bacillus subtilis; se ha mostrado que perjudica a la fosforilación de los azúcares y a su transferencia al interior de la célula mediante una cascada de fosforilaciones que implican las enzimas generales, no específicas del azúcar, EI y HPr, y las enzimas específicas del azúcar EIIA, EIIB y EIIC. La primera etapa es la fosforilación de EI a partir del fosfoenolpiruvato (PEP). La EI fosforilada (EI-P) cataliza la fosforilación de HPr, en la His-15 catalítica. La HPr fosforilada en su His-15 (referida como P-His-HPr) transfiere su grupo fosforilo a EIIA, que a su vez fosforiliza EIIB. La EIIB fosforilada (P-EIIB) asociada a la proteína de membrana EIIC, cataliza el consumo y la fosforilación simultánea de un carbohidrato específico.

Se ha mostrado que los componentes del sistema PTS, y más específicamente, la enzima HPr, están también implicados en otras rutas reguladoras.

Por ejemplo, P-His-HPr puede transferir su grupo fosforilo también a proteínas no PTS, tales como glicerol kinasa [Charrier et al., J. Biol. Chem., 272, 14166-14174, (1997)] o a antiterminadores y activadores transcripcionales que poseen el dominio de regulación PTS (PRD) que contiene diversos sitios de fosforilación reconocidos por P-His-HPr [Tortosa et al., J. Biol. Chem., 272, 17230-17237, (1997); Stülke et al., Mol. Microbiol., 28, 865-874, (1998); Lindner et al., Mol. Microbiol., 31, 995-1006, (1999)]. En todos los casos, la fosforilación dependiente de p-His-HPr lleva a la activación de la función de las proteínas no PTS y esta fosforilación se ha mostrado que sirve como un mecanismo de represión catabólica por carbono secundario en bacterias gram positivas [Deutscher et al., J. Bacteriol., 175, 3730-3733, (1993); Krüger et al., J. Bacteriol., 178, 2637-2644, (1996); Martin-Verstraete et al., Mol. Microbiol., 28, 293-303, (1998)]. En la Lactobacillus casei, el antiterminador LacT, que regula la expresión del operón lac, contiene dos PRD y parece que es controlado por este mecanismo.

En las bacterias gram positivas, la HPr puede también ser fosforilada mediante la HPr kinasa/fosfatasa HprK bifuncional [Galinier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1823-1828, (1998); Reizer et al., Mol. Microbiol., 27, 1157-1169, (1998); Brochu y Vadeboncoeur, J. Bacteriol., 181, 709-717, (1999); Kravanja et al., Mol. Microbiol., 31, 59-66, (1999)]. En la Bacillus subtilis, esta fosforilación, que ocurre en la Ser-46 reguladora [Deutscher et al., Biochemisty, 25, 6543-6551, (1986)], es estimulada mediante fructosa-1,6-bisfosfato e inhibida mediante fosfato inorgánico [Galinier et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 95, 1823-1828, (1998)]. La HPr fosforilada en Ser-46 (referida como P-Ser-HPr), participa en el mecanismo principal de represión/activación catabólica por carbono operativo en bacilli y presumiblemente en otras bacterias gram positivas [Deutscher et al., Mol. Microbiol., 42, 171-178, (1997)]. Funciona como un correpresor para la proteína de control de catabolito CcpA, un miembro de la familia LacI/GaIR de los represores/activadores transcripcionales [Henkin et al., Mol. Microbiol., 5, 575-584, (1991)]. El complejo formado entre CcpA y P-Ser-HPr se ha mostrado que enlaza a los elementos de respuesta de catabolito (cre) [Fujita y Miwa, J. Bacteriol., 176, 511-513, (1994); Gösseringer et al., J. Mol. Biol., 266, 665-676, (1997); Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9590-9595, (1998); Galinier et al., J. Mol. Biol. 286, 307-314, (1999); Martin-Verstraete et al., Mol. Microbiol., 28, 293-303, (1999)], sitios operadores que preceden o solapan los promotores o localizados en la región 5' de los operones y los genes reprimidos por catabolito [Hueck et al., Res. Microbiol., 145, 503-518, (1994)]. Por ejemplo, se encuentra un elemento cre funcional en la región promotor del operón de la lactosa lacTEGF de L. casei, que comprende los genes lacE y lacF que codifican respectivamente las enzimas de transporte de lactosa EIICBLac y EIIALac conjuntamente con los genes que codifican una proteína antiterminadora (lacT), y una fosfo-beta-galactosidasa (lacG) [Gosalbes et al., J. Bacteriol., 181, 3928-3934, (1999)].

Los genes que codifican componentes del sistema CCR, y más específicamente los genes relacionados con el sistema PTS, tales como ptsI y ptsH que codifican, respectivamente, las enzimas EI y HPr del sistema PTS, hprK que codifica la HPr kinasa/fosfatasa, y ccpA han sido caracterizados en algunas especies de bacterias gram positivas.

En la L. casei, el gen ccpA [Monedero et al., J. Bacteriol., 179, 6657-6664, (1997)], y los genes lacT, lacE, lacG y lacF [Gosalbes et al., referenciado anteriormente; Poter y Chassy, Gene, 62, 263-276, (1988); Alpert y Chassy, Gene, 62, 277-288, (1988); Alpert y Chassy, J. Biol. Chem., 265, 22561-22568, (1990); Alpert y Siebers, J. Bacteriol., 179, 1555-1562, (1997)] han sido clonados y caracterizados hasta ahora.

Recientemente, los presentes inventores han identificado, clonado y secuenciado los genes ptsI, ptsH y hprK de la L. casei.

La secuencia nucleotídica del operón ptsHI, y las secuencias peptídicas de HPr y EI de la L. casei se dan a conocer, respectivamente, en el listado de secuencias adjunto bajo los identificadores SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, y SEQ ID NO: 3. La secuencia del gen HprK está disponible en GENBANK bajo el número de acceso Y18948.

Los inventores han estudiado recientemente el efecto de las mutaciones en ptsI, ptsH y hprK, así como el efecto de las mutaciones en ccpA sobre las propiedades metabólicas y el crecimiento de la L. casei. Encontraron, de manera inesperada, que las cepas de L. casei con mutaciones que perjudicaban la regulación del mecanismo de represión catabólica...

 


Reivindicaciones:

1. Utilización de un mutante de L. casei que presenta por lo menos una mutación en el gen ptsH, en la que dicha mutación perjudica la regulación de un mecanismo de represión catabólica por carbono (CCR) que implica la proteína PTS HPr, para la preparación de un producto alimentario.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho mutante presenta por lo menos una mutación seleccionada de entre el grupo que consiste en:

    - cualquier mutación en el gen ptsH que perjudica la capacidad de HPr de ser fosforilada en la His-15, o de fosforilar la EIIA; y
    - cualquier mutación en el gen ptsH, que perjudica la capacidad de HPr de ser fosforilada en la Ser-46.

3. Utilización según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho mutante se selecciona de entre el grupo que consiste en mutantes del gen ptsH que presentan por lo menos una mutación que resulta en la expresión de una HPr que presenta por lo menos una sustitución de un aminoácido en la posición 15 y/o en la posición 46 y/o en la posición 47 de la HPr de tipo salvaje, y/o por lo menos una mutación que resulta en la expresión de una HPr delecionada de por lo menos uno de los aminoácidos 15, 46 y/o 47 de la HPr de tipo salvaje.

4. Mutante de L. casei que presenta por lo menos una mutación en por lo menos el gen ptsH, en el que dicha mutación perjudica por lo menos una de las funciones del producto de dicho gen.

5. Mutante de L. casei apto para uso alimentario, que presenta por lo menos una mutación en el gen ptsH, en el que dicha mutación perjudica por lo menos una de las funciones del producto de dicho gen.

6. Método para la obtención de un mutante apto para el uso alimentario según la reivindicación 5, donde dicho método comprende:

    - transformar la L. casei con un vector integrativo que comprende un gen ptsH mutado, en el que dicha mutación perjudica por lo menos una de las funciones del producto de dicho gen y que comprende, además, un gen marcador selectivo;
    - cultivar las bacterias bajo condiciones selectivas para el gen marcador con el fin de obtener las bacterias que han integrado el plásmido en su cromosoma mediante un evento de recombinación simple;
    - cultivar dichas bacterias bajo condiciones no selectivas para el gen marcador con el fin de obtener bacterias que han experimentado un evento de recombinación doble que lleva a la escisión de las secuencias del vector.

7. Método para la obtención de un mutante apto para el uso alimentario de L. casei en el que la función catalítica de la HPr se encuentra sólo ligeramente perjudicada, donde dicho método comprende:

    - proporcionar una cepa mutante de L. casei en la que el gen ptsI se encuentra inactivado de tal manera que la función de la EI se encuentra totalmente perjudicada;
    - transformar dicha cepa mutante con un vector integrativo que comprende un operón ptsHI que consiste en un gen ptsI de tipo salvaje y un gen ptsH mutante, y que comprende adicionalmente un gen marcador selectivo;
    - cultivar las bacterias en lactosa bajo condiciones selectivas para el gen marcador, y recuperar las bacterias que han integrado el vector en su cromosoma mediante un evento de recombinación simple;
    - cultivar las bacterias seleccionadas en lactosa y bajo condiciones no selectivas para el gen marcador con el fin de obtener bacterias que han experimentado un evento de recombinación doble que lleva a la escisión de las secuencias del vector.

8. Proceso para la preparación de un producto alimentario o un aditivo alimentario en el que dicho proceso comprende la fermentación de un sustrato alimentario con un mutante de L. casei, tal como se ha definido en las reivindicaciones 1 a 5.

9. Proceso según la reivindicación 8, en el que dicho producto alimentario es un producto láctico.

10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, para la preparación de un producto alimentario enriquecido con compuestos de aroma, que comprende la fermentación de un sustrato alimentario con una cepa de L. casei tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Producto alimentario fermentado que comprende por lo menos un mutante de L. casei, tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.


 

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